從細胞到胚胎 人類生命之源研究難越倫理

2013年年中的兩個星期，發育生物學家瑪格達萊納·澤尼卡-格茨（Magdalena Zernicka-Goetz ）非常忙碌，因為她正在追逐一個世界紀錄。澤尼卡-格茨和她在英國劍橋大學的同事正試圖在實驗室培育人類胚胎，而他們要培育的胚胎比以往任何時候都要長！澤尼卡-格茨他們想要更深地了解一團微小的細胞是如何將自身轉變成一個複雜的多部分結構。

圖註：在實驗室內培育人類胚胎。（圖/托比·利）

在研究開始的一星期後，研究團隊不得不考慮終止胚胎髮育，澤尼卡-格茨很清楚，在人類胚胎髮育這個大問題上，除了研究本身，我們還有很多東西要處理，比如說倫理。

有些女性捐獻過卵細胞，而現在她們不需要再進行體外受精了，研究人員就用這些卵細胞展開胚胎研究。研究小組將細胞浸泡在一種特殊的培養基中，並將其安置在保溫箱中，這和之前研究小鼠胚胎的方法是一樣的。因為樣本必須放在嚴格控制的環境中，所以科學家每天只能將這些樣本取出一兩次，以在顯微鏡下追蹤進展。

日子一天天過去，6天、7天，到了第8天，胚胎仍在繼續茁壯成長。「我們都屏住了呼吸，」澤尼卡-格茨回憶道。「一天天變得越來越激動人心。」這支團隊將試驗進行了12天，這是最長的一次，最終他們進行了13天。「這真是難以置信，我對此很興奮，」 澤尼卡-格茨說道。

澤尼卡-格茨團隊取得的進步，以及紐約的一個研究團隊所做的類似壯舉，是過去5年里此領域為數不多的幾項成就之一，他們都致力於促進早期人類發展的研究。研究人員對人類胚胎的接觸一直有限，而且他們對人類胚胎的早期轉變知之甚少。但現在，細胞培養方法的改進使研究人員在體外培養人類胚胎的時間增長至兩周。科學家利用基因編輯技術，如CRISPR技術，來構建人造胚狀結構，以探索形成胚胎的細胞信號和物理作用力（也可理解為環境因素），因為後兩者對塑造胚胎及胚胎的支撐組織起到重要作用。

這些技術在早期主要流程中很重要，比如說著床，著床就是胚胎在很小時將自己嵌到子宮壁上，而到了這個階段，科研人員也就沒法直接對胚胎的進展進行研究了。新的高解析度數字圖像技術這是就用上場了，這種技術可以很好地揭示胚胎肌肉和神經在未來幾周後的發育過程。研究這些，我們就能更好地理解先天缺陷和發育障礙是如何產生的，還能了解為什麼有些懷孕會失敗。

新技術幫了大忙，但同時也將研究人員推向了未知的倫理領域。從20世紀70年代末開始，倫理學家和科學家就「14天法則」達成了一致。也就是說，對人類胚胎的研究限制在受精後的兩周內，因為兩周時胚胎就可能第一次表現出有神經系統的跡象，這也是胚胎分裂的前兆。直到如今，國際公認的14談法則一直是一個純粹的假設限制，因為我們是根據對除人外的其他動物的研究來定的時間紅線。「並不是每個人都認可這個法則，而且現在在技術上可以突破這一法則。」紐約加里森黑斯廷斯中心的生物倫理學家約瑟芬·約翰斯頓（Josephine Johnston）說道。

胚胎操作指南

整個動物界，許多早期發育過程都有著驚人的相似性，每個物種都會在這一階段調整基因或細胞信號。在哺乳動物中，科學家研究最多的是小鼠的胚胎，他們會將每個基因挨個禁用，以測試每個基因的作用。研究小鼠以獲得數據相對容易，而且小鼠也被認為是研究人類胚胎髮育的良好指標，因為小鼠和人的許多早期細胞類型和成分比較相似。但研究人員現在開始質疑這種相似之間的差異究竟有多大。「我們多少已經能夠探索一點人類早期的發展的情況，但有一點很明顯，老鼠和人類胚胎相似，但相似並非一模一樣，」加拿大多倫多兒童醫院的發育生物學家珍妮特·羅森特（Janet Rossant）說道。

圖註：人類胚胎分裂過程圖示。幾十年來，由於技術有限，研究人員只能利用動物實驗或對組織樣本的研究來揣測人類胚胎髮育的早期過程。現在技術發展了，科學家能在實驗室內培育人類胚胎，還能利用人類幹細胞培養胚狀結構。科學家利用基因編輯技術阻斷了人類胚胎早期發育階段中一個重要的蛋白質，這個蛋白叫Oct4，Oct4一被阻斷，胚胎就無法發育成200細胞囊胚。為什麼要提Oct4呢？這回答了上文的疑問，因為小鼠胚胎髮育後期Oct4活動就不明顯，這就是人和小鼠在胚胎髮育早期階段的不同點之一。正是這些小進步、小發現，科學家才能逐漸打開人類早期胚胎髮展的黑匣子。（圖/諾拉·福格蒂；凱西·尼亞坎）

可用於試驗的人體組織比較有限，於是科學家開始利用高效的基因編輯技術，比如說CRISPR–Cas9，來探索胚胎髮育的早期階段。到目前為止，只有少數幾個研究團體獲得了開展此類研究的授權，部分原因大家都能猜到，因為胚胎基因改造具在倫理上比較敏感。

在倫敦弗朗西斯·克里克研究所，發育生物學家凱西·尼亞坎（Kathy Niakan）領導著此領域第一個獲得國家監管結構批准的研究項目。2017年，凱西的團隊報告稱，他們使用CRISPR–Cas9技術來編輯人類和小鼠胚胎幹細胞中的一個基因表達，就是把上文中提到的Oct4蛋白質去掉。去掉之後，人類早期胚胎成不了囊胚了，而小鼠的卻能形成囊胚，但後期發育也會接近停滯。

科學界有一種觀點受到越來越多的支持，即，在非常早期的發展中，某些基因細節，如某些基因的活躍性可能只針對人類有用，上面提到的人和小鼠的對比試驗就是例子。「大多數體外受精胚胎無法發育到囊胚階段，但目前尚不清楚原因，搞清楚哪一步會決定或影響胚胎中第一個細胞類型將有利於我們改善體外受精成功率。」尼亞坎說道。在未來的工作中，尼亞坎希望研究人類哪些基因會使一小部分囊胚細胞繼續發育成更成熟的胚胎。

何處是我家

在形成一個有著200細胞的小球後，小囊胚必須嵌入子宮壁才能存活，這一過程大概在受精後第七天進行。但是一旦囊胚嵌到子宮壁上，科學家也就在很大程度上無法繼續研究接下來的發展情況。觀察著床過程本身就是第一個挑戰，在最近之前，研究人員一直缺乏可靠的方法來維持胚胎髮育超過第一周。

現在，科學家打開了第一個挑戰的黑匣子。在2016年5月發表的兩篇論文中，澤尼卡-格茨團隊和紐約洛克菲勒大學阿里·布里瓦盧團隊報告了第一例能夠將人類胚胎培育12至13天的培養系統。研究人員發現，有了正確的生長因子和營養成分，培養基中的人類胚胎就能「植入」到培養皿底部的表面上。值得注意的是，胚胎不需要任何母體組織來觸發「植入」後的早期重構步驟。「我對此感到很震驚，」布里瓦盧回憶道。「我本以為在實驗室中胚胎進行這種附著後活不了一兩天。」

實驗中，胚胎附著的培養皿要比真正的子宮壁平整的多，這是和實際情況不同點之一。但即便如此，人工培養的胚胎還是創造了幾個里程碑，而此前，我們只能利用動物實驗，或者用流產後收集的人類組織樣本進行有限的研究。在最新的實驗中，

當胚胎附著在培養皿上後，外部細胞層開始分化為早期的胎盤以及其他細胞類型以支持胚胎的成長。在內部，細胞似乎發展成胚胎的前體和卵黃囊，而卵黃囊是為胚胎提供血液的早期結構。大概兩周後，兩個研究小組按照14天法則都結束了試驗。

試驗結束了，一些胚胎的發育過程也就結束了。但研究人員表示，如果下一次進行進一步優化，這些培養系統就可以幫助我們發現胚胎頭兩周發育的更多細節。

圖註：即使不植入子宮，胚胎也能自我組織。圖片上半部分，體外培養胚胎中的細胞開始分化成多種細胞類型，其中紫色部分將變成更成熟的胚胎，而羊膜腔也在形成，羊膜腔將圍繞著胚胎而成長。在動物當中，從第15天開始，從頭到尾的身體中軸以及神經系統開始出現。但有科學家對人類幹細胞培養出的胚胎進行研究發現了不同的結果，他們對14天法則提出了不同的意見。（圖/瑪格達萊納·澤尼卡-格茨團隊；尼克·斯藩塞）

在第三周，也就是原腸胚形成的過程中，會發生幾個關鍵事件。胚胎開始形成一個身體中軸，而軸的一端註定會發育成頭部。所有的細胞開始遷移並分化成三層，這將最終形成人體所有的器官和組織。這個過程太重要了，因此這也是履行14天法則的主要原因。

一些研究人員正在尋找替代方法，他們利用人類幹細胞技術構建合成胚狀結構，這種情況就不用遵循14天法則了。這類構建缺少全面發展的某些至關重要的組件，因此，即使被植入子宮，也發育不成胎兒。2014年，布里瓦盧、埃里克·西賈和他們在洛克菲勒大學的同事發布報告稱，他們利用專門培養的人類胚胎幹細胞在體外模擬了原腸胚形成的過程。他們發現，當幹細胞被限制在幾百微米的範圍內生長時，這些幹細胞就能分化成一種外形看起來像牛眼的細胞，而這種牛眼一樣的細胞又包含著能發育成身體所有部分的三種主要細胞類型。從扁形蟲到靈長類，幾乎在所有的動物中，這些細胞類型都具有類似的作用：中心的細胞變成皮膚、大腦和神經系統，中間層細胞變成肌肉、血液、骨骼和各種器官，最外層的細胞會變成消化系統和呼吸系統。

這類構建的胚狀結構看起來比較扁，而真正的人類胚胎的構造則比較立體，儘管有差異，但在細胞和分子水平上，研究人員原本就期望獲得這種效果。「利用一個系統，我們能分析信號通路和細胞命運之間的關係，」西賈實驗室前博士後研究員阿里耶·瓦姆弗萊士（Aryeh Warmflash）說道。

圖註：胚狀體內的一波又一波信號，紅色和黃色信號更強，藍色信號稍弱，這種信號強弱的差異促使了細胞的分化。（圖/易德塞·海姆斯凱克；阿里耶·瓦姆弗萊士/美國萊斯大學）

對該系統的後續研究已經揭示了胚胎細胞如何利用幾何結構和化學過程來自我組織成不同的組織類型。2016年，布里瓦盧、西賈和他們的團隊演示了幹細胞可以感知自己在圓形集落中的位置的過程，因此，調整它們對生長因子分子的反應就能幫助形成細胞離散區域。2017年，萊斯大學瓦姆弗萊士團隊在《bioRxiv》網站預印本系統上發布的一篇報告展示了生長因子的動力學在胚胎髮育中起著一定的作用。研究人員發現，一組特定的蛋白質釋放出激增的信號，統稱為Nodal信號通路，這波信號像波浪一樣從集落圓周向內擴散，在其擴散初期留下不同的細胞類型。

布里瓦盧團隊研對這個系統的研究更加深入，他們在今年5月7日展示了用生長因子的組合來處理這些類型的集群就能誘導「組織者」細胞的形成，而「組織者」細胞，顧名思義，就是未來組織各類型細胞出現及發育的原始者。除人外的其他動物中，這些特殊的細胞能引導周圍的細胞形成一個有頭有尾的中軸。但是，由於14天法則的原因，科學家從未見過人類組織者細胞的的運轉過程。考慮到人類胚胎工作面臨的倫理限制和技術局限，布里瓦盧取而代之將假定的人類組織者細胞移植到發育中的雞胚上，然後觀察到被移植的細胞指導小雞細胞發展出第二個雞神經系統。

胚胎的支持結構

關於人類早期發展的主題，很多研究都集中在胚胎本身上，但很多其他的組織對胚胎的生存也有至關重要的影響，其中就包括羊膜囊和胎盤，羊膜囊是胚胎的住所，而胎盤則能為胚胎提供氧氣和營養。

為了更好地研究羊膜囊是如何發育的，研究人員用人類幹細胞製造了一個模型。去年，發育生物學家黛博拉·古穆西奧（Deborah Gumucio）、密歇根大學生物工程師傅建平以及他們的同事發現當在凝膠器皿上培養人類幹細胞並用天然的支架分子包圍這些幹細胞時，這些細胞就自我組織成一個類似於羊膜囊的東西。大約24小時後，類羊膜囊上就出現一個口，然後，細胞開始在一側變平，而另一側的細胞就開始拉長，而這正是原腸胚形成前的典型過程。

這個人造模型只複製了胚胎的核心和囊，沒有其他的支撐組織，而後者是胚胎存活生長的必要條件。儘管缺少支撐組織，研究人員仍能識別出一些可能幫助產生這種不對稱結構的分子信號。「就這種人造模型試驗，就現在進行的階段，我們仍有好多重要信息有待發現，所以我們沒理由將其發育成更晚的胚胎，」古穆西奧說道。科學家將這種胚狀結構培養物保持了5天，對應到真實人類胚胎髮育期大概是9到14天，雖然和真實胚胎有差異，但研究人員仍是依據14天法則，在對應的第5天停止了培養。

澤尼卡·格茨團隊正嘗試開發更完整的結構。2017年，格茨團將兩種類型的小鼠幹細胞組合起來進行培養：一種形成胚胎本身，一種有助於形成胎盤，後者稱為滋養層幹細胞。研究人員將培養物嵌在三維支架上，這種合成結構就像是胚胎著床後的環境。現在，研究人員正致力於用人類幹細胞創造出一種類似的胚狀結構。科學家可以藉此更好地了解胚胎組織和胚胎外組織的相互作用，比如說胚胎和胎盤。

隨著一些實驗室開發出這些越來越複雜的合成模型，即所謂的胚胎，倫理問題正在日益凸顯。「我認為這是一個灰色地帶，」位於緬因州巴爾港的傑克遜實驗室的幹細胞生物學家馬丁·佩拉（Martin Pera）說道。「我們應該如何看待這些正在發育的結構？」許多倫理學家和科學家都認為，目前進行的合成胚狀體比較簡單，因此不必一定遵守14法則。但是位於俄亥俄州克利夫蘭的凱斯西儲大學的生物倫理學家玄仁洙（Insoo Hyun）表示，「給胚狀體的特點下定義本身就是一項挑戰，比如說我們很難確定胚狀體發育到什麼程度或是出現何種特點才算是更加接近真實的胚胎。很難把握這個度，現在培養的胚狀體可能已經超越了14天法則，比如說，你把它移植到子宮，它就能發育成更複雜的形態。」

數據重整

研究人員在研究後期階段的解鎖細節方面也取得了一些進展，組織染色和成像技術功不可沒。在2016年《科學》（Science）上發表的一篇報告中，阿姆斯特丹大學醫學中心的研究人員將華盛頓卡內基科學研究所保存的15000個組織切片進行數字化。這些組織切片是19世紀80年代到20世紀前半期期間從流產、手術和屍體解剖中獲得的樣本。荷蘭的一項研究時間跨度超過了兩個月，研究人員用數字技術追蹤了單個切片上多達150個器官的輪廓，然後對截面進行調整對齊重新構建了原始胚胎的三維模型，這個三維模型可以當做活性數據集。

在高解析度下研究胚胎已經有了一些發現，比如說，在胚胎學角度上看，腎臟的出現及發育要經歷三個連續的階段，先後是前腎、中腎和後腎，以前科學界都認為腎臟出現和發育的過程是從上往下發生的，後來有研究小組根據更新的技術發現，因為腎臟的生長速度和椎骨生長速度並不一樣，所以腎臟的出現及發育的過程並不是單向的向下，而是上上下下的起伏式發育。

但是卡內基研究院收集的切片有個主要局限，就是缺少分子標記，這就使研究人員不容易區分出不同的細胞類型。為了克服這些問題，位於巴黎的法國國家健康與醫學研究所的阿蘭·切多爾（Alain Chédotal）在2017年發表了一份新的三維數據集。新的數據集包含36個胚胎和胎兒，這些胚胎和胎兒樣本處在6到14星期的發育階段。阿蘭和其團隊對捐贈的樣本進行組織清理處理，這樣就能使樣本更容易在顯微鏡下成像，然後又進行著色以突出不同的細胞類型。

圖註：隨著神經的發展，左右手也有著不同的分支模式。（圖/阿蘭·切多爾；摩根·貝勒）

根據新的三維圖像，研究人員能在高解析度細節上觀察神經、肌肉、肺和其他器官的發育過程。「就細節而言，這是前所未有的成果，」位於華盛頓的霍華德大學醫學院魯伊·迪奧戈（Rui Diogo）說道。迪奧戈對數據集進行了挖掘，了解到肢體肌肉的發展情況。

迪奧戈研究小組觀察到手部和足部的一些肌肉會在發育過程中出現消失或融合，這些研究結果尚未發表。「當我們還是胚胎時，我們的肌肉和成年後的肌肉很不一樣，」迪奧戈說道。此外，還有其他一些意想不到的發現，比如切多爾報告稱，儘管左右手神經組織具有相似性，但在第7到11星期內，每隻手的細的分支模式會沿著不同的路徑進行發散伸展。

法則的去留

隨著科學技術的改進，研究人員希望對人類早期發展有更多更深的了解，他們還希望闡明導致妊娠丟失和出生缺陷的原因。

研究人員對胚胎早期發育的研究日益清晰，這也使倫理問題越發凸顯。也有一些人認為，隨著澤尼卡-格茨和布里瓦盧的拓展型實驗的進行，科學界和倫理學界應該重新審視14天法則。今年5月，萊斯大學貝克研究所健康與生物科學中心舉行了一次會議，有30位美國科學家、倫理學家和其他專家參與了這次討論，布里瓦盧和約翰斯頓也參加了，他們討論了是否應該打破14天法則，以及打破後應該如何設置新的界限。「我認為最好還是遵守14天法則，如有特殊情況，可通過請願書來破例，」與會的玄仁洙說道。

隨著研究結果的不斷積累，技術上的進步激起了科學家的興趣，同時也加劇了他們的不安。「這是種驚奇而又敬畏的感覺，我們正在觸及人類早期的秘密，因此很多人在道德上與倫理上產生了疑慮，」約翰斯頓說道。「這些疑慮是很好的提醒，即我們在培養皿中研究的東西絕非幾個細胞那麼簡單！」

來源：網易科技

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