下一代測序技術，如何解鎖微生物領域研究？

微生物大約從35億年前開始在地球上進化，並佔據地球生物圈的每個可居住環境。儘管微生物影響著地球上一些關鍵功能，例如碳和養分循環，以及植物和動物的健康與疾病，但數萬億的微生物中有超過99％尚未被發現。此外，由於微生物的多樣性很高，所以很難研究微生物組中複雜微生物群落所執行的特定功能（例如居住在土壤或人類腸道中的所有微生物）。

傳統的微生物檢測方法，難於發現新型或變異的微生物，並且一般需要基於分離培養，但分離培養耗時長，操作複雜，且自然界中約有99%的微生物是不能在實驗室條件下進行培養純化的，其中蘊含著大量潛能微生物及基因資源。因此，需要一種能被所有菌種通用、解析度高、分型能力強、可重複性好、速度快、通量高的微生物檢測方法，高通量測序技術在一定程度上恰好可以滿足這些需求。

微生物研究的「三大黃金時期」

微生物學研究經歷了三個黃金時期，第一個黃金時期大概爆發於19世紀中葉到20世紀初，並一直持續到20世紀後半段，以「發現、培養微生物並闡明其意義」為根本特徵，其中的代表性人物包括列文虎克、科赫、巴斯德、馬歇爾、湯飛凡等。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌、伊爾森氏鼠疫細菌以及我們熟知的益生菌——保加利亞乳桿菌等，就是在這個時期被發現的。微生物學的第二個黃金時期始於20世紀40年代，以「細菌遺傳基礎揭示」為根本特徵。在這個時期，人類明確了遺傳物質的組成和結構、噬菌體與細菌的相互作用原理、利用質粒和噬菌體進行轉化和轉導的方法等，分子生物學工具被大量使用，微生物本身的研究相對減少。而現在我們處於微生物學的第三個黃金時期，以「揭示人體微生物組與健康的關係」為代表性研究方向，人類充分利用各種組學工具，正在全面揭示微生物組的奧秘2。

微生物研究全面進入「測序時代」

佔據測序領域近三十年（從1977年到2005年）的Sanger測序方法曾經需要數年才能完成單個細菌基因組測序，於1995年完成第一個細菌基因組流感嗜血桿菌。隨著新一代測序技術的速度和通量顯著提高以及成本的大幅下降，NGS技術發展到現在僅需不到一天時間即可完成一個細菌全基因組測序，極大促進了對複雜微生物組及其功能的研究。

然而，自然界中超過99%的微生物難以用傳統的方法進行純培養，因此無法對它們開展依賴於分離培養或基礎方面的研究。1998年由威斯康辛大學植物病理學部門的Jo Handelsman等最早提出宏基因組（或元基因組）的概念，源於將來自環境中基因集可以在某種程度上當成一個單個基因組研究的想法，宏的英文是「meta-」，具有更高組織結構和動態變化的含義。後伯克利分校的研究人員Kevin Chen和Lior Pachter將宏基因組定義為「應用現代基因組學的技術直接研究自然狀態下的微生物的有機群落，而不需要在實驗室中分離單一的菌株」的科學。

宏基因組鳥槍法測序，能得到整個環境微生物群落的遺傳信息，而人體微生物組，尤其是人腸道微生物組，基因數量遠超過宿主，更是被稱為人體「第二套基因組」。通過宏基因組關聯研究（MWAS）使得人類微生物組與複雜疾病，如二型糖尿病、肥胖症、肝硬化、結直腸癌和類風濕性關節炎等之間高解析度的關聯研究成為可能3。基於人腸道的微生物組研究關聯研究目前更多處在科研探索階段，除需確定關聯是否代表因果關係的問題，還需要進一步考慮如何在未來使用MWAS進一步闡明疾病的病因、預防和治療干預。

同時，無偏倚宏基因組測序可能徹底改變我們發現病原體的能力，特別是發現新的病原體。2014年美國學者在《新英格蘭醫學雜誌》報道了世界首例採用腦脊液二代測序診斷疑難神經系統感染（鉤端螺旋體感染）的病例。該文指出，由於超過100種不同的傳染因素可引起腦炎，使用培養物進行診斷，血清學和病原體特異性PCR檢測均比較困難，無偏倚的NGS測序與生物信息分析相結合，為臨床提供了一種可行的診斷感染性疾病的方法4。美國FDA於2016年5月13日發布了「基於下一代測序的傳染病診斷設備：微生物鑒定及耐藥性和毒力標誌物的檢測」的指南草案，以確定NGS診斷設備的分析及臨床性能，用於微生物感染的診斷和合適療法的選擇。由此可見，傳染病的NGS檢測已經越來越被接受，應用前景十分廣闊。

華大智造助力微生物領域研究

針對傳染病檢測的這一特定需求，華大智造潛心三年推出了從樣本採集、核酸提取、文庫製備、高通量測序到信息分析的一站式微生物檢測解決方案，同時提供配套的自動化樣本製備系統、一鍵式生信分析伺服器、實驗室信息管理系統及完善的售前、售後支持，能夠幫助廣大科研工作者和一線人員在本地一站式輕鬆實現基於高通量測序的微生物檢測。

一圖讀懂華大智造微生物檢測整體解決方案

1、便捷的樣本採集

MGIEasy糞便樣本採集套裝

在微生物研究或者臨床檢測中，對糞便樣本常溫保存和運輸是一個非常關鍵的環節。國際上該類產品雖有數據支持，產品可靠，但價格昂貴；國內的一些產品雖價格便宜，但缺乏數據支持。而MGIEasy糞便樣本採集套裝既有可靠的數據支持，相關實驗研究發表於專業雜誌《Microbime》上，而且價格又相對便宜合理。

該產品可以在室溫條件下保存糞便樣品14天，即使在40℃的顛簸運輸環境下也能高效地為樣品提供持續保護。適用於16s rRNA微生物分析、鳥槍法宏基因組測序、qPCR及陣列等多項應用。

2、高效的核酸提取

MGIEasy微生物DNA提取試劑盒（磁珠法）

人體微生物宏基因組研究中，一些革蘭氏陽性菌尤其是真菌在裂解時比較困難，導致檢出率偏低，甚至漏檢的發生。市面上針對細菌DNA提取試劑盒在提取真菌時，往往提取效率偏低，操作繁瑣。

該產品針對真菌等難以裂解的菌株裂解配方進行優化，在保證革蘭氏陰性菌提取效率的同時將假絲酵母菌等真菌提取性能提升了10~200倍。該產品適用於血液、血清、血漿、組織等各類樣品的核酸提取，可用於16s rDNA分析、qPCR定量分析、宏基因組測序等後續實驗。

MGIEasy病毒DNA/RNA提取試劑盒（磁珠法）

隨著病毒宏基因組學在臨床醫學檢測領域的廣泛應用，對於DNA病毒與RNA病毒共同檢測的需求比較急迫。

該產品針對於微量病毒樣品的提取進行優化，添加特殊的核酸沉澱劑，極大提升了微量病毒核酸的提取效率。該產品適用於血清、血漿、體液、病毒培養液等樣品，可以用於雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒、雙鏈RNA病毒、單鏈RNA病毒等各種類型病毒的提取，可用於qPCR定量分析、基因晶元、宏病毒基因組建庫等後續實驗。

3、靈活的文庫製備

MGIEasy遊離DNA文庫製備試劑套裝（含環化）

對2-6 ng 血漿cfDNA、150-250bp 片段化的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、腦脊液、糞便DNA進行操作，製備得到高質量的MGI高通量測序平台專用測序文庫。適用於病原微生物快速鑒定，腫瘤液體活檢等應用場景。

特點：

DNA投入量低，2-6 ng cfDNA或片段化DNA（片段主峰150-250 bp）

僅需不到4小時即可完成從DNA到測序文庫的製備過程

MGIEasy通用DNA文庫製備試劑套裝（含環化）

對0.5-50 ng 片段化的單菌或meta樣本DNA進行操作，製備得到高質量的MGI高通量測序平台專用測序文庫。適用於單菌或meta樣本組裝及下游分析，病原微生物快速鑒定和耐葯分析、菌群丰度檢測等應用場景。

特點：

可適用於超聲打斷後從0.5-50 ng 的DNA起始，插入片段範圍可在150-500 bp 之間

僅需不到5小時即可完成從DNA到測序文庫的製備過程

MGIEasy酶切DNA文庫製備試劑套裝（含環化）

對0.1-5 ng 單菌或快培樣本gDNA、0.5-300 ng 腸道、糞便、水體、土壤等meta樣本DNA進行操作，製備得到高質量的MGI高通量測序平台專用測序文庫。適用於病原微生物快速鑒定和耐葯分析、菌群丰度檢測等應用場景。

特點：

DNA投入量低，0.1-5 ng 單菌或快培樣本gDNA，0.5-300 ng meta DNA

僅需不到7小時即可完成從DNA到測序文庫的製備過程

MGIEasy RNA文庫製備試劑套裝（含環化）

對20 ng 150-250 bp 片段化的咽拭子，200 ng 150-250 bp 片段化的血液、糞便等RNA樣本進行操作，對血液和糞便RNA可進行去宿主處理，對咽拭子、組織樣本進行不去宿主處理，製備得到高質量的MGI高通量測序平台專用測序文庫。適用於病原微生物快速鑒定，病毒全基因組拼接等應用場景。

特點：

能檢測咽拭子、血液、糞便和組織等多種樣本類型

對血液和糞便樣本進行去宿主處理，提高檢測靈敏度，提升數據利用效率

4、高性價比的高通量測序

從2013年開始，華大布局自研高通量測序儀，經過5年的努力，華大智造先後推出自研的高性能測序儀BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-2000和MGISEQ-200，特別是MGISEQ-2000和MGISEQ-200，無論是速度、準確性還是集成度，都已經達到世界領先水平。在擁有自主可控的測序技術以後，華大率先降低測序成本，於2017年首先跨入WGS百美元時代，並於2018年正是啟動「測序者計劃」，帶領整個行業進入衝刺完美WGS 100美元時代。

5、整合的信息分析系統

高通量測序的可獲得性越來強，但由此產生的海量數據則需要依賴完善的資料庫及相應的分析流程才能真正實現本地化的微生物檢測。華大智造也同步推出了配套完整資料庫的Meta及單菌快速鑒定系統，幫助用戶完成高通量測序最後的關鍵一環。

【Meta】病原感染快速鑒定系統（PFI）

流程自動化（一鍵生成分析報告）

物種覆蓋廣（一次分析可鑒定萬種微生物）

分析功能全（兼容DNA/RNA數據，鑒定活躍表達的微生物）

資料庫定期更新

【單菌】NGS快速鑒定系統（BFI）

流程自動化（一鍵生成分析報告）

鑒定血清型等基本信息、進行毒力、耐葯和溯源分析

資料庫可更新，可根據用戶需求進行定製

從樣本採集、核酸提取、文庫製備、高通量測序到信息分析的本地化一站式微生物檢測解決方案，為華大智造國產高通量測序平台助力微生物領域研究插上了一雙「隱形的翅膀」。無論是自主可控的國產平台和試劑耗材，還是無需經驗預判、創新的分析方式，單單是全面且持續更新的資料庫就已包含9981種微生物並定期更新，更不必說便捷的工作流程帶來的效率提升和體驗提升。

一圖讀懂華大智造微生物檢測整體解決方案的優勢

此外，作為一個開放的平台，華大智造期待更多同行的參與、合作開發多個維度的基於國產自主高通量測序平台的本地化微生物檢測整體解決方案，不僅包括病原微生物，還包括腸道微生物、皮膚微生物、口腔微生物、水體微生物和土壤微生物等等一系列的解決方案，共同推進微生物研究的新突破。

參考文獻

[1] Richard Allen White III, et al: The past, present and future of microbiome analyses. Nature Protocols, September 2016

[3] Jun Wang and Huijue: JiaMetagenome-wideassociation studies: fine-mining the microbiome. MICROBIOLOGY, AUGUST 2016 | VOLUME 14

[4] Michael R. Wilson, et al: ActionableDiagnosis of Neuroleptospirosis by Next-Generation Sequencing. N Engl J Med 2014; 370:2408-2417

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