細菌基因組完成圖新策略出爐

長讀長序列的獲取對於物種基因組的組裝是一個絕對性的優勢，可以顯著減小組裝難度、提高組裝質量。Nanopore-MinION納米孔單分子測序技術，不需PCR擴增且讀長長，所以自一開始出現就備受矚目；其測序的主要原理是：依賴於不同鹼基在穿越納米孔時會引起電流變化的幅度不同，通過檢測納米孔實時的電流變化推測出核酸分子的鹼基序列信息。

目前，Nanopore-MinION納米孔單分子測序應用地越來越廣泛，尤其適用於高雜合、高重複或大基因組等複雜基因組的高質量組裝。另外，Nanopore-MinION在大腸桿菌、酵母、線蟲等小基因組的組裝方面同樣具有優勢。但是，Nanopore-MinION測序準確率與Pacbio接近，準確率相對低一直是一個無法迴避的問題。

因此，在降低組裝難度的同時為了保證測序準確率，推薦採用以下兩種策略來構建細菌的基因組完成圖：

策略1：三代Nanopore（30×） + 二代（1Gb）

策略2：三代Nanopore（100×）

事實勝於雄辯，下面就來了解下我司利用Nanopore測序組裝得到的某革蘭氏陰性菌基因組的內測結果吧。

建庫測序（~25×）

序列組裝（Unicycler[1]流程）

組裝得到的3條環形分子詳見下表：

相應的組裝Graph如下圖所示，比較完美的3條環形分子。

組裝評估

利用minimap2將reads比對到基因組上，基因組覆蓋率達99.9999%，5×以上覆蓋率99.99%（以此估計錯誤率約萬分之一），整體覆蓋深度基本符合理論的泊松分布（下圖左），且無明顯GC偏好（下圖右）。

但由於Nanopore測序錯誤率相對較高（平均~10%），且對homopolymer的測序精度尤其差，經多輪polish後單鹼基錯誤率依舊較高、存在一些indel導致蛋白移碼錯誤，最終由BUSCO[4]評估得到完整的核心基因比例較低（~80%）。

結論

綜上，即使~25×的三代nanopore測序可以組裝出細菌完成圖，但是單純利用Nanopore測序得到的單鹼基精度還是比較低（特別是有移碼錯誤），所以構建細菌基因組完成圖的最佳策略是：

① 三代Nanopore測序（30×）+ 二代測序（1Gb）；

② 三代Nanopore測序（100×）。

如此，便可以在保證單鹼基精度的同時構建得到細菌基因組完成圖。

參考文獻

[1] Wick R R, Judd L M, Gorrie C L et. al. Unicycler: Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads [J]. Plos Computational Biology, 2017, 13 (6): e1005595.

[2] Li H. Minimap and miniasm: fast mapping and de novo assembly for noisy long sequences [J]. Bioinformatics, 2016, 32 (14): 2103.

[3] Vaser R, Sovi? I, Nagarajan N et. al. Fast and accurate de novo genome assembly from long uncorrected reads [J]. Genome Res., 2017, 27 (5): 737.

[4] Sim?o F A, Waterhouse R M, Ioannidis P et. al. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. [J]. Bioinformatics, 2015, 31 (19): 3210.

[5] Wick R R, Judd L M, Gorrie C L, et al. Completing bacterial genome assemblies with multiplex MinION sequencing[J]. Microbial Genomics, 2017, 3(10).

暑期優惠

暑期來臨，源宜基因的服務熱情依然不會褪卻。只要您在2018年9月30日之前簽訂項目合同，將會享受8折大優惠哦。如有意向，請您微信留言或與當地銷售經理聯繫。

GIF

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！