童明漢/湯富酬/李勁松合作組完成小鼠精子發生過程轉錄組動態變化圖譜

責編丨迦漵

精子發生。圖片來源於：http://medimagery.com/spermatogenesis-illustrations/#prettyPhoto

哺乳動物精子發生是一個高度複雜且受到嚴密調控的細胞發育過程。該過程包含三個最基本的細胞生物學事件：有絲分裂、減數分裂和精子形成。在有絲分裂過程中，精原細胞經歷自我更新、增殖和分化，保證了精子發生的持續性和穩定性；在減數分裂過程中，發生同源染色體配對、重組交換與精確分離，在保證遺傳穩定性的基礎上產生了配子遺傳物質的高度多樣性；在精子形成過程中，則發生了頂體形成、鞭毛組裝、組蛋白-魚精蛋白轉換、核濃縮和包裝重建等一系列複雜的分子和形態學變化，使精子細胞具備了運動和受精潛能。上述過程中生精細胞類型的多樣性和生物學事件的高度複雜性決定了精子發生是研究基因表達調控的絕佳模型。

數十年來，儘管哺乳動物精子發生的研究取得了長足的進步，但是仍然存在著許多制約因素限制了哺乳動物精子發生的研究，使其進展相對於其它學科顯得較為緩慢。例如，目前尚無高效和通用的精子發生體外培養體系； 缺乏獲取高純度的、均一的、處於特定發育階段的各級生精細胞的實驗技術。因此，當前對精子發生機制的研究大多基於類型混雜的群體細胞的系綜平均研究，而非均一性的單個細胞的系統研究。

7月30日，中科院生物化學與細胞生物學研究所童明漢課題組、李勁松課題組與北京大學湯富酬課題組合作在Cell Research在線發表了題為Single-cell RNA-seq Uncovers Dynamic Processes and Critical Regulators in Mouse Spermatogenesis的最新研究成果。該工作開創性地將精子發生同步化方法與生殖細胞特異性熒游標記相結合，建立了分離獲取高純度的、均一的、處於不同發育階段的任意類型的小鼠生精細胞的實驗體系，應用單細胞轉錄組測序的方法，繪製了小鼠精子發生過程的轉錄組精細圖譜。該工作系統揭示了精子發生過程中基因表達調控的動態變化；篩選、驗證了不同發育階段的關鍵調控因子；證實了不同發育階段精子細胞與卵細胞結合後產生的胚胎具有不同的發育潛能；並系統地總結了精子發生過程中RNA可變剪接的動態變化、減數分裂性染色體失活（MSCI）等多種關鍵生物學事件的核心規律。

1.分離高純度的均一的各級生精細胞的策略

精子發生是一個連續且非同步化的過程，表現為生精上皮的細胞組合存在周期性變化，沿生精小管縱軸方向的不同位置處於不同的生精上皮周期。睾丸內生精細胞類型的複雜性則源於生精上皮周期性釋放的維甲酸信號——維甲酸為精原細胞分化的必需因子，精原細胞分化的不同步造成了不同生精上皮內生殖細胞組合的多樣性。

基於精原細胞分化的機理，該研究通過對新生小鼠連續7天飼餵維甲酸合成通路的抑製劑WIN 18,446，使精子發生阻滯於未分化型精原細胞階段，在第8天通過腹腔注射維甲酸，使精原細胞同步分化。由於分化後的細胞周期相對固定且同步，通過對維甲酸處理不同時間點的小鼠系列取材，可獲得不同發育階段的生精細胞。而未分化型精原細胞不受同步化的影響，為了避免其污染，該研究構建了生精細胞特異性攜帶紅色熒光蛋白（Vasa-dTomato）的基因敲入小鼠模型和未分化型精原細胞特異性攜帶黃色熒光蛋白（Lin28-YFP）的基因敲入小鼠模型。紅色單陽性的細胞即為同步化的目的細胞，可以通過單細胞採集系統Unipick獲得單個細胞或FACS分選收集目的細胞群體。基於上述方法，該研究分離並鑒定了20類處於精子發生不同時期的細胞類型（下圖），並利用高精度單細胞轉錄組測序的方法建立了上述不同發育階段的轉錄組詳細圖譜。

研究流程示意圖及該研究中的20種生精細胞類型

2.生精細胞轉錄組的動態變化

通過對20個階段的1,204個生精細胞進行高精度單細胞轉錄組測序，經過嚴格的質量控制後，剩餘1,136個細胞用於後續的分析。基因表達數目結果顯示，在整個精子發生過程中，生精細胞需要調動基因組近90%（20,088個基因中的18,037個）的蛋白質編碼基因的表達（下圖a）；與此同時，各階段生精細胞轉錄水平存在明顯的動態變化。其中晚粗線期與雙線期精母細胞達到整個精子發生過程的轉錄峰值，而在晚細線前期與細線期階段則為轉錄低谷期（下圖b）。聚類結果顯示，20類生精細胞可以劃分為7大類。有趣的是，同處於DNA複製的早細線前期與中晚期細線前期精母細胞被聚類到了不同的類群之中（C1與C2），提示早細線前期（ePL）向中晚期細線前期（mPL）的轉變可能是減數分裂過程潛在的重要轉折點；同為圓形精子細胞的RS2（C5）、RS4與RS6（C6）和RS8（C7）則被分為三群，提示其功能可能存在顯著差異。

（a）箱式圖展示了20個階段的生精細胞中已知蛋白質編碼基因的基因數量；（b）t-SNE分析將生精細胞劃分為C1至C7共7個新類群

3.精子發生過程中關鍵調控因子的篩選與驗證

參與減數分裂過程的新基因

減數分裂是生殖細胞所特有的生物學事件，是生物有性生殖的基礎。在此過程中，同源染色體的非姐妹染色單體間發生配對、聯會和重組交換，從而使配子呈現遺傳多樣化，增加了後代的適應性。如此複雜的生物學過程需要眾多因子的共同協調，而在此之前已知的調控因子並不全面，有待進一步挖掘和闡明。

該研究通過系統的生物信息學的分析發現了與減數分裂重組過程相關的重要基因，包括Prdm9、Gm960、Meiob等，它們均特異表達於細線期或偶線期精母細胞內。與此同時，還發現了一些未知基因，包括Fbxo47、Pparg、Ccnb3等也表現出同樣的表達模式。提示這些未知基因可能在減數分裂重組過程中發揮關鍵調控作用。

該研究選擇了Fbxo47基因開展進一步的功能驗證，此前的報道認為Fbxo47基因和人類癌症相關，但是其具體功能仍是未知。該研究構建了Fbxo47的條件性基因敲除小鼠，功能研究發現生精細胞內特異性失活Fbxo47基因的小鼠表現為雄性不育。睾丸切片H&E染色結果顯示，Fbxo47基因敲除的成年小鼠的精子發生阻滯於生精上皮的第Ⅳ期，同時發生大量精母細胞凋亡的現象（下圖a）。免疫熒光染色結果進一步顯示，Fbxo47基因敲除的成年小鼠生精上皮內沒有粗線期精母細胞及後續細胞類型，表現為減數分裂前期I停滯（下圖b）。上述結果進一步證實了該研究建立的精子發生過程轉錄組精細圖譜在篩選參與特定生物學事件的潛在調控因子的可靠性。

（a）8周齡野生型小鼠睾丸和Fbxo47基因敲除小鼠睾丸切片的H&E染色結果；（b）8周齡野生型小鼠和Fbxo47基因敲除小鼠睾丸切片的免疫熒光染色結果。

精子發生過程中重要的轉錄因子

精子發生過程具有很強的階段特異性，在不同階段中有著不同的轉錄特徵，而轉錄因子被認為是在精子發生過程中調節了基因表達的時空特異性。

為了尋找調控精子發生關鍵轉變節點的轉錄因子，該研究分別分析了有絲分裂向減數分裂轉變過程和減數分裂向精子形成轉變過程中的轉錄因子共表達調控網路。共表達網路結果顯示，c-fos/c-jun和Zfp316在有絲分裂向減數分裂轉變過程中具有潛在的調控作用（下圖a）。而在減數分裂向精子形成轉變過程中，除已報道的在生精細胞發育過程中發揮著重要功能的Crem和Rfx2外，該研究還篩選出像Sox30和Zfp541這樣未知的潛在轉錄因子（下圖b）。

有絲分裂向減數分裂轉變（a）及減數分裂向精子形成轉變（b）過程中的轉錄因子共表達調控網路。其中，黃色圓點表示各個轉錄因子，連線表示轉錄因子之間的關聯

為了驗證這些未知轉錄因子的作用，該研究對小鼠進行了Sox30基因的全局性敲除或生殖細胞特異性敲除。功能研究發現不論是全局性敲除的小鼠還是條件性敲除的小鼠，都表現為雄性不育。組織學H&E染色發現，Sox30基因敲除小鼠的精子發生表現為精子形成障礙，生精上皮內沒有長形精子，少量的圓形精子細胞聚集形成多核巨型細胞。通過對頂體的染色，發現Sox30基因敲除小鼠的精子發生阻滯於圓形精子形成的第3~4步，提示Sox30基因在調控精子形成中的關鍵作用（下圖a）。

為了探究Sox30調控精子形成的機制，研究人員從Sox30條件性基因敲除小鼠中獲取了49個第3步圓形精子細胞用於單細胞轉錄組分析。和野生型相比，Sox30基因敲除組和對照組細胞內基因表達差異明顯，存在兩千多個差異表達基因（1,153個突變組下調基因和895個突變組上調基因）。通過對差異表達基因做GO分析發現，Sox30基因敲除組下調的基因與精子形成密切相關。為了進一步尋找受Sox30直接調控的下游靶基因，該研究開展了SOX30的ChIP-seq實驗。通過與RNA-Seq的結果共同分析，在基因敲除組下調的基因中找到233個潛在的受Sox30直接調控的關鍵靶基因。通過GO分析發現，這些靶基因與精子形成密切相關，例如Chd5,Hils1和Sun5等（下圖b）。

Sox30基因敲除阻礙了小鼠精子細胞的發育。（a）8周齡條件性敲除小鼠（Sox30-cKO）和對照組小鼠（control）的睾丸組織切片H&E染色和熒光染色結果，其中PNA標誌著精子細胞的頂體；（b）野生型、條件性敲除、全局性敲除小鼠在3個代表性基因上ChIP-seq的結果。

4.第1~2步圓形精子相較於第7~8步圓形精子受精產生的胚胎具有較低的發育潛能

基於該研究建立的各級生精細胞的高精度轉錄組數據，研究人員篩選獲取了特異性表達於不同發育階段圓形精子的表面標誌物，包括Cd37、Cd63、Cd96和Cd177等。流式細胞分選實驗證實了CD63陰性能夠成功地富集第7~8步的晚期圓形精子細胞；而CD63強陽性則能夠富集第1~2步的早期圓形精子細胞。這一實驗結果提供了一種利用表面標誌物分離獲取不同發育階段圓形精子細胞的策略。

為了觀察不同發育階段的圓形精子細胞是否與其授精後胚胎髮育潛能相關，該研究進一步通過同步化方法及表面標誌物分選的方法分別獲取了早期圓形精子細胞和晚期圓形精子細胞，應用胞質圓形精子注射（Intracytoplasmic Round Spermatid Injection，ROSI）實驗證實了晚期圓形精子細胞注射所得胚胎髮育至囊胚的比率顯著高於早期圓形精子細胞注射所得胚胎（下圖）。因此，第1~2步圓形精子相較於第7~8步圓形精子與卵細胞結合後產生的胚胎具有較低的發育潛能；提示人類臨床上和動物實驗上較低的ROSI成功率很可能是因為使用的圓形精子細胞中很大一部分是早期圓形精子而導致的。如果能夠使用上述新發現的表面標誌物將晚期圓形精子特異性富集出來用於ROSI，將有可能大幅度提高其成功率。

第1~2步圓形精子相較於第7~8步圓形精子具有較低的胚胎髮育潛能

5.精子發生過程中可變剪接的動態變化

在精子發生過程中會存在著大量的可變剪接事件。該研究通過對來自精子發生13個關鍵階段的66個單細胞進行全長RNA-seq測序，結果發現可變事件在各階段生精細胞內的分布情況與基因表達數目的動態變化極為相似，提示了可變剪接伴隨著轉錄過程，是精子發生過程中轉錄後調控的重要表現形式（下圖a）。同時，在該研究中還發現在各個階段的生精細胞中，內含子滯留（intron retention）和外顯子跳躍（exon-exon junction）類型的可變剪接事件始終是佔比最高的可變剪接類型。

（a）柱狀圖展示了不同精子發生階段中，每個細胞中至少含有2種可變事件的基因的平均數量；（b）堆積柱狀圖展示了相鄰階段差異基因和可變變化之間的關係

為了研究在相鄰階段之間發生變化的可變剪接事件，該研究將每個階段的單細胞合併在一起，然後重新計算了每個階段的可變剪接情況。結果發現，如果僅考慮兩個階段中至少有一個階段存在可變剪接的情況，可以明顯看到內含子保留是佔比最高的可變剪接變化，這也就提示內含子保留可能是參與生精細胞轉錄後調控的重要手段之一。

為了觀察可變剪接和基因表達之間的具體關係，該研究分析了相鄰階段之間差異基因的可變剪接變化。結果發現，當生精細胞從前一個階段過渡到下一個階段時，上調的差異基因更傾向於保留內含子而抑製表達，此時對應的RNA就會先儲存起來而不進行蛋白質翻譯。然而，下調的差異基因則更多的是轉變為剪接成熟的轉錄本，這樣的行為是有利於正常翻譯使用的（上圖b）。

6.性染色體基因表達的動態變化

在精子發生過程中，性染色體上的基因有其獨特的表達方式，即會發生減數分裂性染色體沉默（Meiotic Sex Chromosome Inactivation，MSCI）現象。然而由於受細胞純度問題的困擾，對該現象的理解及其發生機制的研究一直不夠深入。

該研究通過詳細比較不同發育階段生精細胞內性染色體基因表達的水平，詳細歸納了不同基因的表達情況，並將這些基因劃分成了MSCI PMSC、MSCI escape PMSC、escape MSCI等（下圖a）。其中PMSC（Post Meiotic Sex Chromosome Inactivation）指的是減數分裂後性染色體相關基因不激活的狀態，已有的觀念認為，性染色體上基因在完成減數分裂後，仍舊處於轉錄抑制狀態，此種現象稱之為PMSC。同時，在該研究中發現不同性染色體基因的不同表達模式與其功能是密切相關的，例如escape MSCI的基因功能與染色質的重塑密切相關，提示這些基因可能參與了精子形成過程（下圖b）。

（a）熱圖展示了MSCI-PMSC、MSCI-逃逸PMSC、逃逸MSCI、RS特異性共5種類型的性染色體上基因在精子發生過程中的表達變化；（b）逃逸MSCI基因的GO富集分析結果

總的來說，該工作通過將分離均一性不同發育階段生精細胞的實驗體系與單細胞轉錄組測序技術巧妙地結合起來，繪製了一幅高精度的小鼠精子發生轉錄組圖譜，全面揭示了小鼠精子發生過程中基因表達的高度動態性與時空特異性，並在此基礎上對找到的關鍵候選基因通過基因敲除和直接下游靶基因檢測等策略進行了深入的功能和機理研究，為後續全面研究精子發生調控機制提供了理論基礎和寶貴資源，並對臨床男性生殖障礙的診療提供了理論指導，為最終闡明哺乳動物精子發生的分子調控機制提供了可能途徑。

中國科學院生物化學與細胞生物學研究所博士生陳瑤（現為博後）、北京大學北京未來基因診斷高精尖創新中心博士生鄭宇軒和高雲、中國科學院生物化學與細胞生物學研究所博士生林震和楊蘇明為該文章並列第一作者，童明漢研究員、湯富酬教授、李勁松研究員為該文章的共同通訊作者。

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