Cell丨破解突觸的建立與可塑性調節的機制

突觸是神經元間發生信息傳遞的連接點，具有高度動態性，故而在分子層面研究突觸的形成及調控機制非常困難。香港科技大學張明傑教授課題組長期從事神經信號傳遞過程中關鍵支架蛋白結構與功能相關研究，2016年，他們在Cell上報道了突觸後緻密區（PSD）中高丰度表達的兩個蛋白PSD-95與SynGAP在體外較高濃度下可以發生液-液相分離，為腦科學領域長期存在的關於PSD形成的問題提供了一個可能的答案。不過，關於突觸的形成、維持與動態調節機制，仍然存在許多疑問。張明傑教授課題組最新發表在Cell的工作為解答上述問題提供了重要的理論支撐。

撰文丨溫文玉（復旦大學生物醫學研究院 研究員）

突觸。圖片源自：https://www.neuroscientificallychallenged.com/glossary/synapse/

現代神經科學的一個研究熱點是探索人類大腦中近千億不同類型的神經元如何連接，追蹤神經信號傳遞的路徑，以期繪製完整的腦神經環路——這就是席捲全球的「腦連接圖譜」計劃。腦圖譜計劃的實施無疑已為，並將持續為我們理解大腦的生理及病理機制提供重要的理論基礎。然而可以預計的是，該計劃的完成並無法解答所有的神經科學問題，其中一個原因在於，神經環路並不像電腦環路一樣是靜止的、通過簡單的線性連接構成。突觸——神經元間發生信息傳遞的連接點，是高度動態的。

突觸的概念最早於120年前被Charles Sherrington提出, 隨後一直是神經科學研究的重點。經過上百年的研究，儘管突觸的化學組成、形態、動態特性及基本功能機理均已大致清楚，然而由於突觸的一些特性，在分子層面研究其形成及調控機制非常困難，主要原因主要包括以下幾個方面：

01

數目眾多，形態各異。每個神經元可以有多至上萬個突觸，但大腦中很難找到兩個完全一樣的突觸，意味著突觸並不是由簡單的重複結構單元組成；

02

突觸是高度區室化、自我組裝的亞微米尺度的微反應器（圖1A）【1】。區室中的蛋白組分決定突觸的性質，如興奮性或抑制性。以興奮性突觸為例，每個突觸都包含一層蛋白質高度聚集的區室——突觸後緻密區（postsynaptic density，PSD）負責大腦信號的處理和傳遞（圖1B）。PSD蛋白編碼基因突變是導致自閉症、精神分裂症和智障等精神疾病的主要原因；

03

突觸具有高度的可塑性，可以在幾秒內改變其化學組成，進而發生形態改變（如神經棘頭的增大/減小），這一特性與腦功能密切相關，但突觸可塑性的分子機制目前尚不清楚。研究表明神經棘頭的大小與PSD的尺寸，以及突觸上谷氨酸受體的數目正相關。在不同的神經信號刺激下，PSD蛋白可發生組裝/去組裝；

04

PSD呈膜半包埋狀態，一面接觸質膜，另一面則直接接觸胞質。目前尚不清楚這些沒有物理隔斷（如雙層膜）的區室是如何自發形成並穩定存在的，更不用說其隨著突觸刺激信號改變組分，進而增大或縮小的調控機理。

圖1. 神經突觸為高度區室化的微反應器，突觸後緻密層PSD是由多結構域支架蛋白構建的傳遞神經信號的複雜蛋白網路。【1,3】

張明傑教授（香港科技大學教授，中國科學院院士）課題組長期研究神經極性建立與維持、神經信號傳遞過程中關鍵支架蛋白的結構與功能，特別是針對突觸後緻密層PSD中包含PDZ、GK等結構域的主要支架蛋白(如PSD-95, GKAP, Shank, Homer等)，開展了系統深入的研究工作【2，3】。這些多結構域支架蛋白通過相互作用、招募其他蛋白形成高度聚集、複雜的蛋白作用網路，一端連接膜上的離子通道/受體，另一端連接細胞骨架，從而特異高效地調控神經信號傳遞，並與突觸的形態關聯在一起（圖1C）。由於PSD蛋白網路的複雜性，早期張老師實驗室的策略是以模塊化的形式將蛋白網路分割成單一的蛋白作用對，進而研究其在溶液中的相互作用機理，解析其複合物結構，最後將該蛋白作用對添加至PSD蛋白網路。該方案是理解PSD形成機理的關鍵中間步驟，但其局限也是顯而易見的，因為在體PSD中蛋白質高度聚集，外觀呈半固體或凝膠狀，顯然不是體外研究中類流體的稀釋液狀態。

研究方案的改進來自一次意外迸發的靈感。張老師組曾夢龍博士偶然發現PSD中高丰度表達的兩個蛋白PSD-95與SynGAP，在體外較高濃度下（遠高於其生理濃度）可以發生液-液相分離(liquid-liquid phase separation，LLPS)進而形成高度濃縮的PSD-95/SynGAP聚集體。重要地是，引起自閉症的SynGAP或PSD-95功能缺陷突變可改變PSD-95/SynGAP濃縮相的形成以及神經元的突觸信號活性。該研究於2016年發表於Cell【4】。

近幾年，生物大分子的相分離研究呈現一個井噴的態勢，多種重要的無膜細胞器以及質膜下的信號傳導複合體的形成相繼被證實由特定組分的相分離過程所驅動，多種人類疾病如神經退行性疾病也與生物大分子的相變密切相關【5-7】。結合PSD-95/SynGAP研究工作，以及突觸的特性，他們推測突觸中高丰度表達的多結構域支架蛋白，通過結合膜錨定的離子通道/受體，可能也可以發生液-液相分離進而自發形成類似PSD的蛋白聚集體。

通過體外重組方法，他們證實了這一猜想，相關工作以Reconstituted postsynaptic density as a molecular platform for understanding synapse formation and plasticity為題發表在最新一期Cell雜誌上【8】。

主要發現點如下：

01

PSD主要支架蛋白PSD-95, GKAP, Shank和Homer 在混合後可以發生相分離進而自發組裝形成蛋白高度聚集的PSD濃縮相，每個蛋白可以在該濃縮相及周圍溶液中發生快速的動態交換。這些支架蛋白間的多位點作用模式可以顯著降低發生相分離的蛋白濃度閾值至生理濃度(~ 1μM)；

02

該PSD濃縮相具有高選擇性，可以進一步聚集谷氨酸受體（如NMDA受體）和突觸活性調節酶（如SynGAP），並通過招募聚集G-actin、cortactin促進肌動蛋白束形成。重要的是，該濃縮相可以選擇性地驅逐Gephyrin，一個重要的抑制性突觸支架蛋白的進入（圖2），這可能是決定突觸性質（興奮性/抑制性）的重要因素；

03

該PSD濃縮相中蛋白組分越多，分離相越固化。由此可以推測，在體條件下神經元中PSD聚集體的多位點模式比體外系統高的多，應該趨於凝膠狀甚至玻璃狀結構，與電鏡觀測結果類似；

04

發展出一種利用共聚焦顯微鏡成像技術精確測定分離相中蛋白濃度的方法。進而發現濃縮相中蛋白的濃度存在一個上限，到達該濃度後繼續增加溶液中蛋白只會使濃縮相體積變大，而內部蛋白濃度基本不會再增加；

05

PSD相分離在雙層膜結構中仍然可以發生，此時相分離發生的蛋白濃度更低，而分離相的形狀變得不規則，形成網狀結構，類似神經元中PSD的形狀；

06

該PSD類似結構呈現蛋白網路性質，可以被模擬神經元活動協同調控。發現Homer1a可以通過與Homer3競爭結合Shank3 ，抑制相分離介導的PSD類結構的形成，該數據完美吻合小鼠睡眠過程中因Homer1a過表達引起的PSD尺寸變小【9-10】。

圖2. 蛋白質相分離介導的PSD形成與動態調節。【8】

這項工作提示神經元中高度緻密的PSD很可能通過特異蛋白的相分離自發形成並穩定存在。該相分離介導的PSD類似結構具有與均一溶液相大相徑庭的特性，卻剛好契合突觸的功能，對於理解突觸的建立、維持與動態調節具有重要的指導意義。儘管該體外重組的PSD類結構僅包含幾個組分，但作為一個簡易有效的分子平台，可以與在體實驗相結合，進一步探索PSD其他組分調控PSD動態組裝的功能。

論文共同第一作者曾夢龍博士（左）與Xudong Chen博士（右），通訊作者張明傑院士（中）

參考文獻

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