遺傳學大牛最新《Science》利用CRISPR實時記錄每個細胞的歷史

Church表示：「我是一個技術狂，我曾預測到將來可能會在人體細胞中編輯基因，於是一旦將實驗室組建起來，就立馬投入這項工作，並且發現在人體細胞中編輯DNA很有效。」

著名遺傳學George Church是哈佛醫學院的遺傳學教授、Wyss研究所的核心成員。他開發了首個直接基因組測序和DNA多重化方法，為1994年破譯首個細菌基因組合2003年的二代測序技術奠定基礎。在CRISPR/Cas出現在大眾視野之前，Church就已經撰文詳細介紹了Cas9 靶定方法、改造進展，並就未來臨床上的潛在應用提出建議。

在最新的一項研究中，Church研究組發表了一項新技術，可以利用不斷發展的遺傳條形碼來記錄發育中小鼠細胞分裂的過程，追溯小鼠體內每個細胞的譜系單細胞來源。 這種方法能幫助科學家確定不同細胞出現的位置和時間，以及不同細胞類型之間的密切關係，從而前所未有地深入探索從受精卵到成年人的這個奇妙生命旅程。

這一研究成果公布在Science雜誌上。

生命奇妙旅程

隨著生物機體的發育，每個細胞都從其親本細胞中繼承了hgRNA序列突變，並獲得其自身獨特的突變，然後將其傳遞給後代細胞。通過比較身體不同部位（肺，肝和神經元）的細胞之間的突變模式，科學家可以確定這些部位何時發展，以及它們彼此之間的密切關係。

人體開始於單個細胞，細胞重複分裂形成兩個，然後是四個，然後是八個，一直到構成新生兒的約260億個細胞。追蹤這些260億個細胞是如何以及何時從一個受精卵中產生的，是發育生物學的一大挑戰，這個領域到目前為止只能捕獲和分析部分快照圖像。

CRISPR條形碼

「當前的譜系跟蹤方法只能及時顯示快照圖像，要想看清楚每一步，必須在物理上停止發育過程，就像看電影的各個幀一樣」，Church說。

遺傳條形碼是使用特殊類型的DNA序列創建的，該序列編碼一種稱為歸巢指導RNA（hgRNA）的修飾RNA分子，設計hgRNA分子使得當存在Cas9（CRISPR-Cas9）時，hgRNA將引導Cas9至其基因組中的自身hgRNA序列，然後Cas9進行切割。細胞修復切割時，它可以在hgRNA序列中引入基因突變，其隨著時間累積以產生獨特的條形碼。

「這種條形碼記錄方法使我們能夠重建每個成熟細胞發育的完整歷史，就像實時向後播放完整的動態圖像一樣。」

這種方法令細胞譜系追蹤成為了可能，通過不斷發展的遺傳條形碼，記錄發育中小鼠的細胞分裂過程，追蹤實現每一種譜系。小鼠體內的細胞可以追溯到它的單細胞來源。

研究人員通過創建一種「原始小鼠（founder mouse）」在小鼠體內構建hgRNA-Cas9系統，該小鼠在其基因組中有60種不同的hgRNA序列。然後，研究人員讓表達Cas9蛋白的小鼠與原始小鼠雜交，產生受精卵，受精後hgRNA序列開始切割和突變。

「在受精卵分裂的每一個細胞中，它的hgRNA都有可能發生變異，」第一作者，Wyss Institute和HMS的博士後研究員Reza Kalhor博士解釋道，「在每一代中，除了從母細胞中遺傳的細胞外，所有細胞都獲得了自己獨特的突變，因此我們可以通過比較它們具有的突變來追蹤相關的不同細胞。」

每個hgRNA可以產生數百個突變等位基因。總的來說，它們可以生成一個獨特的條形碼，包含成年小鼠中約100億個細胞中每個細胞的完整發育譜系。

解答關鍵問題

通過連續記錄細胞發育過程，研究人員也可以解決關於胚胎大腦的長期問題——首先大腦是將其前端與後端區分開來，還是先將其左側與右側區分開來？

研究人員通過比較兩隻小鼠腦部不同部位的細胞中存在的hgRNA突變條形碼，發現每個腦區左側的神經元與同一區域右側的神經元關係更密切，這說明，在中樞神經系統發育的左右patterning之前出現了前後腦patterning。

「這種方法使我們能夠進入模型生物體的最終發育階段，並從那裡重建一個完整的譜系樹，一直追溯到它的單細胞階段。這是一個有野心的目標，肯定需要許多實驗室幾年才能實現，但本文代表了實現目標的重要一步，」Church說。研究人員現在專註於改進他們的讀出技術，希望可以分析單個細胞的條形碼並重建已記錄的譜系樹。

「隨著時間的推移，能夠連續記錄細胞歷史將成為是發育生物學中的一個重要里程碑，它有望以指數方式增加我們對單細胞生長形成成年動物的過程的理解，如果應用於疾病模型，它可以提供關於疾病如癌症如何出現的新見解，」Wyss研究所創始主任Donald Ingber說。

其它條形碼研究進展

Aaron McKenna和同事們開發出了一種叫做GESTALT的譜系追蹤方法。這種方法將獨特的突變模式引入到了稱作為基因組條形碼的短遺傳序列中。隨後利用子細胞中突變條形碼的DNA序列來重建細胞譜系關係。

McKenna等在細胞培養物和活體斑馬魚中證實了這一技術的效力。在斑馬魚的胚胎階段引入條形碼，並在成年期分析各種組織，研究人員發現少數的幾個胚胎祖細胞生成了構成成體器官的大多數細胞。例如在4月齡的斑馬魚中觀察到1,138個基因變異體中只有5個生成了98%以上的血細胞。

作者們指出，在未來的分析中可以利用這一新技術來追蹤正常發育中更加複雜的多細胞過程，還可以利用它來鑒別出腫瘤和轉移灶的細胞起源。

原文標題

Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR

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