生物分析方法中殘留效應和污染的評估與消除策略

本文主要圍繞在生物分析方法中遇到分析物殘留和污染的問題進行闡述。分別從法規要求、評估方法、儀器廠商的應對思路以及殘留和污染問題的消除策略幾個方面進行了概述。希望大家在實際的工作或學習中遇到相應問題時，能夠快速排查和解決問題，從而提高工作效率。

一、前言

殘留（carryover）和污染（contamination）有多種不同的定義。在色譜分析中，殘留經常是評價廠家儀器質量優劣的一個考核指標。當所有的死體積都已經被考慮了，殘留主要是工程設計和進樣系統相關的函數。它是由於前一個樣品中的被測物少量滯留於系統「死」體積中並被引入到下一個進樣的樣品，或者是由被測物在進樣系統中的吸附而造成的現象。

污染可定義為空白基質及實驗對照組，給葯前及安慰劑組樣品中出現待測物的峰。污染也可能出現於校正標樣、質控樣品及實際樣品中，但由於這些樣品中含有待測物，使得污染較難被檢測。污染也可能由和待測物在保留時間及質譜特徵上極其相似的不明來源其它物質產生的「峰」造成。相對於殘留，污染具有更多的隨機性和多源性，這使它更難以被診斷和糾正。

二、法規要求

（一）殘留效應

2015版《中國藥典》中規定：應該在方法建立中考察殘留並使之最小。殘留可能不影響準確度和精密度。應通過在注射高濃度樣品或校正標樣後，注射空白樣品來估計殘留。高濃度樣品之後在空白樣品中的殘留應不超過定量下限（LLOQ）的20%，並且不超過內標的5 %。如果殘留不可避免，應考慮特殊措施，在方法驗證時檢驗並在試驗樣品分析時應用這些措施，以確保不影響準確度和精密度。這可能包括在高濃度樣品後注射空白樣品，然後分析下一個試驗樣品。

FDA在2018年05月頒布的《生物分析方法驗證指導原則》中要求：研究樣品的殘留應該被評估，殘留不應超過20%的定量下限。EMA在2011年的生物分析方法驗證指南中表明殘留評估可通過在一個高濃度或定量上限（ULOQ）校正曲線點後分析空白樣品來獲得。這個空白樣品中，殘留的響應值應不超過LLOQ的20%，內標殘留的響應不超過5%的常規內標響應。

（二）污染

通過設定不包括空白樣品（不含分析物和內標的處理過的基質樣品）和零濃度樣品（含內標的處理過的基質），進行評價潛在干擾的來源，方法嚴重不存在干擾峰不能保證樣品分析中就沒有污染。此外，待測物的污染可能發生在試劑和空白基質中（處理過的和未經處理的）。

FDA更關注的是污染對LLOQ的影響。根據指導原則，校正曲線的最低濃度作為LLOQ應滿足以下條件：

1、分析物在LLOQ的響應值是空白樣品響應值的5倍以上；

2、分析峰可辯、清晰、可重複、精密度20%以內、準確度80%~120%；

3、對於選擇性而言，應有證據證明測定的物質是指定的分析物；

4、方法特異性應用至少6個毒理的同種基質來建立。

三、殘留和污染的評估

（一）殘留的評估

殘留可劃分為三類：

（1）傳統意義上的或真正的殘留，主要來自於系統的設計；

（2）由吸附導致的殘留；

（3）由不完全洗脫形成的殘留。

殘留影響的估算，對固定的殘留：殘留影響百分比（ECI%）=RC×CR×100

相對殘留（RC）=空白中峰面積/前行樣品峰面積×100

濃度比（CR）=前行樣品濃度/後續樣品濃度×100

非傳統意義上的殘留如果由吸附造成，僅會在數個或多個樣品進樣後出現。質譜檢測器本身也可能由一種被稱作「串擾」的現象而導致殘留。這種現象有離子不能及時從碰撞室中移走而產生。當在「舊」的質譜儀器上使用選擇反應監測（SRM）檢測多個分析物且停留時間短時，可能會產生這個現象。

（二）污染的評估

污染可分為三大類，如下所示：

（1）樣品在儲存中和樣本製備前被分析物污染。它與從人體/動物取樣到樣品轉移至樣品管的過程有關。

（2）樣品在準備過程中被分析物污染。是指樣品在分析前的處理中如提取及在進樣器上放置時產生的。

（3）有表現像待測物的未知化合物造成。這些污染物可能導致LC-MS/MS離子一直或偶爾增強。此外，前面分析樣品中保留長物質也會造成污染。

無論臨床前或臨床樣品，污染可有空氣因素、採樣失誤、轉移和運輸、不幹凈的容器和試劑、內標同位素純度不足造成。從實驗的操作來看，污染可產生於樣品的採集過程中。如在臨床或動物房及生物分析實驗室。

1、空氣中的污染

空氣中的污染可有很多因素導致。樣品製備過程的溶劑揮發會產生外濺及氣溶膠，其程度與96孔板的形狀和揮發溫度有關。

使用手動和自動的液體工作站時，氣流可影響轉移的過程。許多因素，包括通風廚和空調氣流力度與方向的影響都可在實驗室設計時予以解決。如果控制不好會造成各類污染，特別是待測化合物。

2、給葯、樣品採集及儲存過程的污染

污染可能發生在生物分析實驗室之外，如動物房和臨床中心，由於給葯或採集操作失誤。給葯失誤有許多可能性。例如，待測藥物給了對照組的動物或安慰劑組的人，或者對照組的藥劑被待測藥物或高劑量被當低劑量使用。環境因素也會導致污染，如餵食在不同籠中小鼠/大鼠時產生失誤。同樣地，對照組和給葯組的動物接觸時由於互相舔黏有食物的皮毛而污染。

臨床前樣品和臨床樣品的污染可發生在樣品採集和儲存的任何環節。例如，樣品會被錯誤的指示（對照組與給葯組互換）或在紅細胞（RBC）分離血漿時重複使用一次性的滴管。凍存前不正確放置血漿樣品造成交叉污染（例如，由水平而不是垂直放置導致樣品管的泄漏）。

3、樣品準備中的污染

如果沒有認真對待，一下的樣品準備及分析步驟（AP）會出現污染問題，常見問題如下。

（1）樣品弄混：分析了錯誤的樣品。

（2）樣品轉移/取樣：樣品放入錯誤的管孔。

（3）儀器污染：待測物吸附到分析儀器的表面。

（4）重複使用一次性實驗器皿。在LC-MS分析中，應盡量使用一次性的試驗器皿，移液器的槍頭和容器用後應扔掉。有時，因為某些原因這些會被重複使用。

（5）飛濺及溶液爬壁。

常見的「飛濺」問題是有槍頭和液體表面的遠距離造成。特別是對於低黏度的液體，有時候儘管可以在移液工作站吸液後可以吸一段空氣泡，但這仍然是常見的污染問題。如果吹乾用的氮氣探針與液體表面太近或氮氣的壓力太大，迸濺也會發生在96孔板液體乾燥的過程中。另一個在溶劑吹乾過程中常見的問題是，如果氮氣流速和溫度不合適，易揮發溶劑會產生爬壁現象。

4、試劑污染

有時候待測化合物意外加入到試劑中也會造成污染。當這種情況發生時，待測化合物會出現在一個特定分析批的所有樣品中，如空白、校正標樣、QC及實際樣品。在樣品製備和色譜中使用頻率最高的溶劑應該是水。水質不一定是水能否在LC-MS中使用的指標，然而定義水的純度對數據記錄及追溯是必需的。從儲存容器、採樣管、流路中產生的有機提取物是另一個污染源。這些干擾物質包括增塑劑、洗滌劑、潤滑劑和用於校正質譜的聚乙二醇（PEG）。

5、內標污染

化學同系物依然是內標的傳統選擇，但是鑒於EMA的推薦，穩定同位素標記（SIL）的化合物作為內標則更加流行。化學同系物內極少會含有與待測物相似或同時出峰的雜質。然而，如需在同一分析批次中同時分析代謝產物的話，這些內標因其合成過程中會產生一些與代謝物相似的雜質而經常會引起問題。同位素標記的化合物可能因製備過程的不完善而含有大量未標記的化合物。徹底去除這些未標記的化合物並不容易，因此方法的使用者應設法保證任何新一批的同位素標記內標不會影響到LLOQ。

四、各大儀器廠商應對策略

通過對儀器設計進行優化，以減少殘留的因素是各大儀器廠家孜孜不倦去追尋的目標。進樣系統的設計是控制一般殘留的主要著眼點。例如，進樣針是否從指定的樣品管取樣並注射到進樣閥或進樣針是否與液相色譜流量串接，這樣液相流動相能從中通過。生產廠家致力於減輕殘留的做法之一是減少系統的死體積，同時會考慮控制吸附和開發合適的淋洗液。

然而依靠生產廠家解決所有類型化合物的吸附是不可能的。事實上，儘管不鏽鋼系統對一些化合物吸附很小，應用中依然需要使用聚合物管線和進樣閥來減少其它化合物的吸附。雖然大多數的殘留與進樣系統相關，柱材料上（如填充材料、柱頭濾芯）的吸附可能會很嚴重。四大儀器廠商對這些問題的考慮與解決方法如下所示：

（一）島津（Shimadzu）

島津公司新一代的液相系統，Nexera/SIL-30ACMP號稱是比同類系統的殘留更小且進樣周期更短。新的系統減少了接觸面積，使用了特殊塗層和表面處理加上新的密封圈。

（二）沃特世（Waters）

Waters最新的超高壓液相色譜儀型號是Acquity UPLC I-class，該系統號稱比其先前系統的殘留地，因而會增加質譜的靈敏度及校正範圍。另一款新開發的儀器是H-Class Bio，它的超純化系統為生物大分子分析中污染及殘留的問題提供了選擇。

（三）安捷倫（Agilent）

安捷倫1290 Infinity LC及LC-MS系統，是利用進樣針座反衝來消除系統相關殘留的技術。液相部分殘留的來源安捷倫公司解剖如下：

（1）針與毛細管材料的吸附；

（2）針的設計、密封或磨損部件（死體積和吸附）；

（3）閥上轉子、設計、磨損（死體積主導的吸附）；

（4）毛細介面失調（所有節點都會被污染，增加死體積）；

（5）樣品柱上死體積與介面和節點的吸附及固定相與樣品的結合。

（四）賽默飛（Thermo Scientific）

Thermo開發了Accela Open自動進樣器，樣品可以保存在進樣針和進樣孔之間。利用軟體可控制兩個溶劑來清洗整個流路。

五、生物分析中殘留和污染的控制和解決方案

（一）殘留和污染的識別及確認

殘留可以通過在高濃度的標準或QC樣品之後分析空白基質來評估。另外，可在分析批的起始分析數個基質空白來確認樣品分析之前系統乾淨無污染。同時，也將空白基質置於分析批的其它位置（ULOQ校正標樣或高濃度QC樣品之後）來監控分析過程的殘留影響。試劑空白和溶劑空白也可以用來監控分析過程的殘留。如果最高濃度校正標樣後的空白信號超過了LLOQ的20%或其內標超過類常規內標響應的5%，則可確定有嚴重的殘留問題。

同樣地，污染的存在也可通過檢測機制空白、試劑空白和溶劑空白中化合物或內標的存在來判斷。分析批中給葯前、對照組或安慰劑組樣品需檢查化合物存在與否。如果這組樣品中任何一個出現超過LLOQ的峰，分析中可能出現了污染。前面已經提到常見殘留可能產生的原因。此處需要特別提出的是，對於肽類及蛋白類樣品產生殘留效應的原因主要有以下幾點：

1、樣品的非特異性吸附作用

殘留效應是指色譜分析中，在高濃度樣品後進樣空白樣品仍然有分析物信號出現。殘留效應是由於殘存的檢測物質不可逆的吸附在系統中引起的。超過10個氨基酸組成的肽稱為多肽，大於50個氨基酸的多肽被歸類為蛋白質。肽類或蛋白類藥物分子與容器表面相互作用在很大程度上取決於分子的大小和其特定的氨基酸側鏈。

氨基酸分子具有兩性的行為特點，它們可以帶一個或幾個正/負電荷，如果所帶正負電荷總量相等，可以視為中性分子。通常，帶正電荷的肽類及蛋白類分子易與帶負電荷的玻璃表面發生靜電作用，而中性的肽類及蛋白類分子會與疏水性材料聚丙烯發生疏水性相互作用。這樣，肽類及蛋白類藥物易吸附於容器壁、吸管端及檢測系統中。而樣品稀釋劑溶解性差是引起靈敏度下降、非線性行為和重複性差的主要原因。儘管使用穩定的同位素內標能夠糾正後兩個問題，但不能糾正由於吸附造成的肽損失。

2、質譜檢測靈敏度的影響

新一代質譜儀檢測器的靈敏度不斷提高，檢測限低於pg/mL的範圍，所用標準曲線動態範圍大於104數量級，這將大大增加方法開發中殘留效應出現的風險。

（三）殘留或污染的消除策略

1、樣品進樣前的殘留部位及消除策略

在樣品製備階段，吸附現象可以發生在移液管頭、離心管中。因為固體表面積結合容量有限，在低濃度溶液中，蛋白多肽類樣品的相對吸附損失程度較高。因此，吸取樣品前要充分潤洗移液管頭。而樣品吸附程度主要取決於溶劑和表面之間的吸附平衡常數，其影響因素有:有機溶劑的添加劑的種類、酸/鹼的pH大小、表面活性劑、置換劑的種類、進樣小瓶的類型及自動進樣器溫度。

（1）有機溶劑、酸/鹼的添加及小瓶類型的影響。對於大多數蛋白多肽類分子同時具有疏水性基團和可電離基團，因此可以運用有機溶劑和調節溶劑酸鹼度來提高其溶解度，以降低分析樣品的非特異性吸附。低比例的甲酸( formic acid,FA)、三氟乙酸( trifluoroacetic acid,TFA)或乙酸( acetic acid,HAC)常常應用於酸化液，而氨水或碳酸氫銨適用於鹼化溶劑。在載樣過程中，使用高比例有機溶劑在增加溶解度的同時，會降低分析物與反向色譜柱間親和力，導致蛋白多肽類樣品發生「突破」而損失，這在注射大體積樣品時尤其注意。對於普通Eppendorf小瓶，添加30%乙腈或15%二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide,DMSO）和1% FA，能有效去除殘留。此外，分析物和進樣小瓶內壁間的吸附平衡常數受樣品體積比的影響。為了避免接觸面體積比的變化，在進樣小瓶的複位回收過程中，每個小瓶最好只進行一次獨立的注射進樣。對於含有機物的樣品，有機溶劑還會通過進樣小瓶的瓶帽揮發而造成損失。

（2）表面活性劑。使用表面活性劑如聚山梨酯-20、壬基-β-D-葡萄吡喃糖甙、聚乙二醇辛基苯基醚、甘油等均可以防止蛋白多肽類樣品的表面吸附作用。但對低濃度樣品進行LC-MS /MS分析時應避免使用這些表面活性劑。因為此類表面活性劑能抑制分析樣品的電離，影響分析方法的靈敏度。

（3）自動進樣器溫度。有研究指出在樣品進樣前，若不設置自動進樣器溫度，那麼樣品的峰面積就會有所差異。同時，發現蛋白多肽類樣品在不同的自動進樣器溫度（4～20℃）下儲存24 h，其穩定性不受影響。然而，當樣品分子的主要組成為易氧化的氨基酸，如半胱氨酸、蛋氨酸和/或色氨酸殘基就會有顯著殘留效應。因此分析者選擇自動進樣器溫度時應該權衡分析物的溶解度和穩定性的影響。

（4）添加置換劑。添加置換劑也稱載驅排劑，是一種可以減少非特異性吸附的有效方法。為了不使生物樣品組成複雜化，在蛋白多肽類樣品稀釋液中增加了0.05%的基質（如大鼠血漿）以及30%甲醇和10%乙酸。由於稀釋液中含有機溶劑、酸和血漿，其有效地塗層在特定位點，可以減少殘留效應。牛血清白蛋白或結構類似物的添加也是這個目的。

2、液相系統中污染或殘留的消除策略

分析工作者在選擇適當的溶劑沖洗進樣路徑和色譜柱前，必須要充分考慮固定相類型、樣品環和連接管的材料等。事實上，色譜柱填充材料、柱壁以及管路與進樣樣品的物化作用都會導致殘留。為了有效地減少殘留效應，首先確定LC-MS /MS系統中引起殘留的主要部位。如果是柱子引起殘留，可以運行一個雙梯度或斷開進樣閥流路，使液相泵將流動相直接泵入柱子並觸發數據採集。因為在設置中已經排除自動進樣器的干擾，所以分析物第二個梯度的峰響應值就成為測量柱殘留的尺度。也可以除去柱子的影響，評估完全由自動進樣器引起的殘留。而對於質譜儀的組件，如離子源噴霧針管和噴射機孔等部分也可以導致殘留。

此外，系統殘留常見情況如下所示：

（1）系統管路連接不當；

（2）使用大內徑（大於20 μm）的毛細管和套管；

（3）毛細管切斷不整齊以及熔融石英的使用；

（4）進樣閥的轉子或定子表面發生機械劃痕。為減小LC-MS /MS系統由於死體積而導致的殘留，研究者可以限制連接套管長度，消除套管間縫隙等。

此外有研究表明，對於肽類和蛋白類物質，可以通過添加2,2,2-三氟乙醇（2,2,2-Trifluoroethanol, TFE）至流動相中，以提高肽類溶解能力和穩定C18疏水鏈，而去除強吸附在柱中的蛋白類或肽類物質。同時，流動相添加乙腈比添加異丙醇或甲醇除殘留效果好。

3、質譜系統殘留或污染的消除策略

儘管質譜系統產生殘留的概率較小，但真空介面及質譜儀Q0部位可以通過噴射機孔表面的污物和加熱系統元件的方式產生殘留。因此要定期清洗離子源噴霧針管和噴射機孔，噴霧針可拆下超聲清洗，噴射機孔要用要用無塵紙沾溶劑甲醇/水（1:1）擦拭。通常情況下，生物分析檢測的動態範圍是有限的，當殘留不能夠最小化時，可以用一雙量程檢測或大量稀釋後再分析樣品，以覆蓋複雜肽類或蛋白類樣品的寬動態範圍。

六、小結

綜上所述，殘留和系統是日常分析工作中常見的問題。因為殘留和污染會影響到方法的精密度和準確度，所以監督管理機構也是一直關注其對實驗數據的影響。在此種情況下，儀器供應商肯定會繼續提高產品質量。同時，材料科學技術的不斷提升，都將會對殘留問題有更好的解決方案。另一方面，生物分析研究人員應致力於充分理解和識別殘留和污染及其對數據的影響，以便於進行原因的調查。

七、參考文獻

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Center for Drug Evaluation and Research (CDER), May 2018.

[2] 生物樣品定置分析方法驗證指導原則, 中國藥典2015年版.

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[5] Mitulovic G, Stingl C, Steinmacher I, et al. Preventing carryover of peptides and proteins in nano LC-MS separations[J]. Analytical chemistry, 2009, 81(14): 5955-5960.

[6] 液相色譜-質譜（LC-MS）生物分析手冊 最佳實踐、實驗方案及相關法規[M], 李文魁等 譯, p296-312

（限於筆者水平，如果本文有不足之處，請予以諒解。最後，希望能和大家一起交流學習）

排版：Herman

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