傳奇PCR：從科學狂想到普通醫學檢驗室，這個故事裡每個關鍵人物都手握諾獎

1993年，Kary Mullis因發明了聚合酶鏈式反應（PCR）獲得了諾貝爾化學獎[1]。1998年，《紐約時報》一篇文章提到PCR時，不吝惜讚美地寫道，「生物學以此劃分為PCR前和PCR後兩個時期。」[2]

這並非溢美之詞。自雙螺旋被闡明，人們對生命的理解進入DNA分子時代，幾乎所有需要研究遺傳物質的人，都無法離開PCR。

在它出現以前，擴增DNA序列需要在細菌中進行，整個過程可能需要幾周；使用PCR，你只需要幾個EP管，把原材料加進去丟進熱循環儀，然後靜靜等上幾個小時，就能夠得到幾何數級的產物。

從高中課堂到頂尖實驗室、從醫院到外太空，PCR默默地綻放著光芒[3]。

而在它的背後，幾乎每個值得被記錄下來的名字都手持諾獎。

撰文 代絲雨

來源 Dr.Why

沙之塔

說起來還真有點兒怪，PCR使用範圍之廣，很難讓人相信它是一種出現還不到半個世紀的技術。換個角度理解，PCR也可以算是某種程度的厚積薄發，它能夠取得今日的成就，還是因為站在巨人的肩膀上。

1953年4月，DNA的雙螺旋結構首次與世人見面[4]，人類對生命終極的認知走入了分子層面，發現者之三Waston、Crick和Wilkins因此在1962年被授予諾貝爾生理學或醫學獎。

在探索DNA結構過程中做出貢獻的科學家們，左一、左二、右二獲得1962年諾貝爾生理學或醫學獎

1957年，美國科學家Arthur Kornberg發現了第一種DNA聚合酶[5]，人類了解到，DNA的複製是在引物引導下、由酶的作用、以脫氧核苷酸為材料向單一方向延伸。當然，在複製之前，還有更複雜的打開雙螺旋等等過程。Kornberg在1959年獲得了諾貝爾獎。

Arthur Kornberg

差不多同一時期，印度裔美國科學家H.Gobind Khorana成功破解了所有的密碼子。為了完成人類功能性基因全合成的偉願[6]，他在此後的科研生涯中開創了許多合成寡核苷酸所需要的技術。1968年，他因破解遺傳密碼獲得諾貝爾獎。

三年後，Khorana和他的學生Kleppe在《分子生物學雜誌》上發表了一篇論文[7]，文內首次提到了雙引物系統和「修補複製」的概念，這是PCR技術的雛形。

H.Gobind Khorana漫畫形象

1969年，Tomas Brock從黃石國家公園的高溫溫泉中鑒定到了全新的耐熱細菌，Thermus aquaticus[8]。

1976年，Jhon Trela和他的學生，華人科學家錢嘉韻成功從該菌種內提取到了能夠耐75℃以上高溫的TaqDNA聚合酶[9]。

發現了Thermus aquaticus的熱泉口

1971年，Cetus Coporation宣告成立，這家公司的創始人之一Donald Glaser是1960年諾貝爾物理學獎獲獎者。頂尖的科學家、前沿的科學視角，讓這家公司成為日後孕育PCR技術的搖籃。

1977年，Frederick Sanger發明了桑格測序法[10]，基因組全面向人類敞開，再無秘密。他因此在1980年獲得諾貝爾化學獎。

至此為止，PCR技術所需的所有基礎材料都已擺上桌台，只剩耐心等待天選之人的到來。

折戟的獨角鯨

Cetus是出現得最早的生物技術公司之一，只可惜，這家本有希望成為業界領頭羊的公司只在歷史上出現了短短20年。這短暫的時光里，它帶來了包括白介素-2、β干擾素在內的幾種重要藥物，以及最關鍵的PCR技術。

Cetus也很關注DNA診斷，它與Perkin-Elmer共同研發了第一台熱循環儀，還與柯達合作商用診斷試劑盒（對就是那個柯達）。

創始之初，Cetus致力於研究工程菌的自動化篩選方法，這些細菌可以用於生產大量的化學原料、抗生素以及疫苗的組分。

那個年代，生物學時時刻刻都在發生巨變，沒過幾年，DNA重組技術、單克隆抗體、基因表達這三項革命性的技術出現，新的生物技術產業即將成型。Cetus快速跟上節奏，1981年首次公開募股，便籌集了1.08億美元。這個數字即使放到今天，也值得稱上一句天價IPO。

cetus是鯨魚座的意思

Cetus的業務中心主要都放在白介素-2上。這塊競爭十分激烈，除了Cetus以外，還有Genentech、Immunex（後來成了Amgen的一部分）等頗有實力的公司，以及一位名為Tadatsugu Taniguchi的日本研究者在進行IL-2基因的克隆研究。

1982年，Taniguchi率先完成了人源IL-2的克隆，不過次年Cetus就搞定了獨家的重組版本，同時用於治療腎癌的臨床試驗也開始進行了[11]。

看看現在IL-2用得多廣，我們就知道這塊蛋糕確實美味。Cetus對它寄予厚望，幾乎把全公司的資源都傾倒在IL-2的開發上，甚至在FDA還沒有批准上市之前，Cetus已經為IL-2建造了兩座工廠和配套的基礎設施，前期的資金投入高達1.27億美元。

值得一提的是，為了支持IL-2的研發，Cetus從1987年開始就對外授權PCR技術的使用，儘管當時很多外部人都認為PCR才是Cetus最有價值的產品。

然而很悲劇，1990年，FDA駁回了Cetus對IL-2的上市申請。實際上當時Cetus的IL-2產品，患者的響應率並不是很高，只有10%-20%的腎癌患者獲得了有效治療；與之相對的是，藥物的副作用巨大，嚴重的液體瀦留可能會危及患者生命[12]。

FDA認為還需要更多的臨床試驗來驗證IL-2的效果，現在它還未到時候。可是Cetus等不起了。當年，Cetus年報虧損23%，CEO辭職，公司不得不通過大幅度裁員來消減成本。

然而這也沒能拯救Cetus下墜的趨勢。1991年，Cetus被成立於1981年的後起之秀Chiron以7億美元的價格收購。次年，IL-2才以Prileukin之名進入市場，同時PCR技術專利被羅氏控股Hoffman公司以3億美元全盤收購。

冠上Chiron名字的IL-2

說來遺憾，Cetus擁有當時業界頂尖的科學家、雄厚的資本、有前景的產品，但是在IL-2上過於孤注一擲。這賭博似的行為導致了全盤皆輸，Cetus一夜消失在了歷史的洪流里。

不務正業的天才

現在讓我們回到1953年，雙螺旋發現的那一年。那年Kary Mullis 8歲，正是和小夥伴們漫山遍野瞎跑的年紀。在他出生的1944年，薛定諤出版了《生命是什麼》。當然了，8歲的他既看不懂這部生物學著作，也完全理解不了DNA結構的發現到底意味著什麼。事實上很長一段時間裡，他都對生物學毫無興趣。

Kary Mullis

比起生物，Mullis反倒在化學領域上顯得頗有天賦。十幾歲的時候，他就從家裡偷來糖，混上藥店裡買來的硝酸鉀，和小夥伴們自製火箭；在喬治亞理工學院修習化學學位期間，他也常常自己合成有毒物質和爆炸物。很幸運，幾乎沒人管他，那段時光讓Mullis掌握了不少有機化學知識。

所以到底為什麼他選擇了生物化學作為接下來的研究方向呢？Mullis自述只對小分子感興趣，而PCR出現之前的DNA又長又「穩如泰山」，和他喜歡的化學合成完全搭不上邊。修完碩士修博士，在加州大學伯克利分校讀了六年生物化學，到1972年畢業，Mullis依舊是只懂化學，不懂生物。

好在他的導師Joe Neilands很寬容，他並不限制學生選課程，所以Mullis赫然選修了一門天體物理學。神奇的是這門課他可能學得不錯，甚至在1968年時發表了一篇名為《十年逆轉的宇宙學意義》的論文，發在《自然》上。多虧了這篇論文，要不然他恐怕拿不到博士學位。

Mullis此時應該沒想到自己日後的成就

畢業後，Mullis沒有想好要做什麼，於是就先隨著妻子來到堪薩斯州。起初他想當個作家（執念很深，後來確實出書了），但是遺憾的是毫無天賦。隨後他在醫院工作了一段時間，又因為離婚回了伯克利，做了兩年餐館的經理人。

這裡要提到一位好朋友Tomas White，是這位朋友勸說他回到學校繼續深造，也是White介紹他到Cetus工作，後來又在Mullis難以立足的時候拉了他一把。

Mullis來到加州大學舊金山分校，進行藥物化學的博士後研究。學習期間，他了解到，DNA也可以通過化學方法來合成。Mullis對此產生了興趣。1979年，他來到Cetus的時候，也是負責合成寡核苷酸，給公司其他部門的同事使用。

Mullis確實在化學合成上有天賦，他很快搞出了計算機自動合成程序，工作流程大大簡化。1981年，他就當上了實驗室的負責人。

128號公路

1983年春天的一個夜晚，Mullis載著當時同在Cetus工作的女友從舊金山前往鄉下度過周末。汽車行駛在蜿蜒盤旋的128號公路上，此時一個念頭出現在Mullis的腦海中——擴增DNA片段時，如果同時添加兩條引物，分別擴增正義鏈和反義鏈，那麼只要引物足夠，豈不是可以無限循環地擴增下去！

Mullis馬上靠邊停車，掏出紙筆開始演算。這種擴增方法，每個循環得到的DNA都是上一循環的二倍，那麼循環10次DNA就能擴增1000倍，循環個30次就能達到10億倍！

這個數字太驚人了，這個思路也太簡潔了，Mullis一時之間都無法相信，之前居然從未有人嘗試過。他反覆查閱資料之後，在Cetus內部的科研會議上分享了自己的想法。然而奇怪的是，同事們完全不覺這有什麼厲害之處。

Mullis花了幾個月時間尋求認同，但贊同他觀點的科學家寥寥無幾，這期間他與女友的感情也出現了裂縫，直到9月，他才開始第一次實驗。

如果順利，DNA將不斷以倍數擴增

在諾獎致辭中，Mullis提到他不喜歡重複勞動，如果一件事需要反覆做同一個流程，那麼他會傾向於寫個程序來解決。所以那個夜晚，他把聚合酶加入試管後就徑直回家了，滿心以為DNA已經在管中自己成倍增加了。

然而第二天中午，Mullis沒能在凝膠中看到期望的條帶。他不得不承認，反覆地加熱、冷卻、添加聚合酶，這枯燥的工作是繞不過去的坎兒。

接下來的三個月里，Mullis磨磨蹭蹭地進行著實驗，同時為了感情問題焦頭爛額。終於在飄雪的聖誕節，他終於成功實現了擴增一個pBR322質粒的一個25bp長的片段，同時也失去了愛情。

結束的開始

事情進展並不順利。1984年中，Mullis再次在Cetus的會議上向同事彙報了自己的成果，結果依舊無人感興趣。也是在這個會上，Mullis和另外一位同事發生了口角，上升到了肢體衝突。這個突發事件以Mullis降職、另一人離開公司結束。

Mullis的好友White此時已經當上了Cetus的技術副總裁，他幫助Mullis拉起一支小組專門研究PCR，其中有個名為才木的日本人。不知是不是日本人天性嚴謹又勤勞，這支小組成立後，研究很快得到了推進，他們成功擴增了一個110bp的人源蛋白基因片段。

進行了更多的嘗試之後，研究者們決定撰寫兩篇論文，Mullis主導的一篇介紹PCR技術理論，才木主導的另一篇介紹PCR技術的應用。

出於某些原因——筆者本人相信可能是Mullis的拖延癌又犯了——當才木的論文寫好時，Mullis幾乎還沒動筆。

在前幾節我們提過，此時Cetus正把全力投在IL-2開發上，公司急於從科研公司轉型到製藥公司，沒有時間耗費在不知能不能變現的技術上。高層沒法等Mullis完成論文，便催促才木趕快先把應用論文發表。

12月，才木的論文發表在了《科學》上，題目是《β-珠蛋白基因組序列的酶促擴增和限制性位點分析診斷鐮狀細胞貧血》[13]。

Mullis的論文就沒那麼好運了，他先後投了《自然》和《科學》，都因為內容不夠「原創」被拒稿，最後不得已投了《酶學方法》，論文直到1987年才出版[14]。

同一年裡，Cetus內另一組科學家也在為PCR的進化添磚加瓦。PCR最初的版本使用的是來自大腸桿菌的DNA聚合酶，這種酶不耐熱，必須每個循環都重新添加，大大降低了自動化程度。

Cetus與Perkin-Elmer合作開發的熱循環儀原型機，因為需要持續添加DNA聚合酶，所以採用了敞口、機械臂移動的方式

從耐熱菌中分離聚合酶的想法是誰提出的不確定，最後進行這項工作的是David Gelfand和Susanna Stoffel。兩位科學家在秋天從Thermus aquaticus中分離到了能夠在95℃高溫下依舊不失活的TaqDNA聚合酶，Taq酶馬上就被應用到了PCR中。

這就是我們現在也在使用的PCR第一次完整出現。

1986年的熱循環儀原型機

幻覺中的情聖

看起來PCR已經走過最艱難的時刻，是該享受光輝和榮耀的時候了。然而不知為什麼，共過苦的夥伴，卻很難同甘。

一方面，是PCR發明人的身份爭議；另一方面，Cetus對PCR團隊也著實不太公平，雖然Mullis獲得了一萬美元的獎金，但是團隊里的其他人只是象徵性地收到了一美元，這讓他們與其他團隊之間的分歧更大了。1986年，Mullis選擇了離開Cetus。

1991年，Cetus折戟夢途；1992年，身價3億美金的PCR專利去往新東家Hofmann-La Roche；1993年，Mullis登上諾貝爾領獎台，大談童年時光與128號公路上的那個夜晚[15]。

Mullis與PCR的故事其實到這裡就差不多已經全部說完了。縱觀他的一生，Mullis表現出很多並不那麼像個德高望重的諾獎獲得者的特徵。

Mullis在諾貝爾獲獎致辭中反覆提到分手的女友，甚至表示獲獎的喜悅也抵消不了失去這個姑娘的悲傷——就算那已經是十年前的事情了——表現得像個痴心的情聖，可他50歲前就結了四次婚。據稱他在男女關係上確實不那麼保守，也曾因此在公司內引發問題。

White把Mullis描述為一個充滿創造力，但是有些過於隨心所欲的角色[16]。Mullis才華橫溢，而且沒有對權威的畏懼，但是另一方面他並不那麼自律，實驗進行得斷斷續續，這是他無法在Cetus內部取信於人的原因之一。他倆的友誼最後沒能持續下去，但在之後的輿論紛爭中White一直站在Mullis的一邊。

Mullis還有些不那麼登得上檯面的小愛好。1938年，Albert Hofmann首次合成了LSD，這種物質在十年後被引入精神疾病治療領域，然後在短短几年時間內成了倍受年輕人喜愛的時髦小玩意兒，成為史上最有名的致幻劑[17]。Mullis上學的時候也好這一口——這是他親口告訴Hofmann的——並且Mullis認為LSD帶來的幻覺幫助他在128號公路上找到了PCR的靈感。

Mullis還有些甚至不太像科學家的地方。比如他認為HIV病毒並非AIDS的病因、全球變暖是個偽命題；他相信占星術，相信轉世，還宣稱自己曾與偽裝成熒光浣熊的外星人對話[18]。

還有一個有趣的細節。前文曾講過，Kleppe1971年發在《分子生物學雜誌》上的論文首次提到了修補複製的概念，也提到了雙引物系統。

人類學家Paul Rainbow曾寫過一本書「Making PCR：a story of biotechnology」，詳細地講了整個PCR的發現故事[11]，書中提到，其實1969年的高登會議上，Kleppe就公開發表過這個觀點，當時在場的科學家中有一位名為Stuart Linn。

巧了，這位科學家正是Mullis就讀加州大學伯克利分校期間的一位老師，而Linn也的的確確曾在課堂上演示過Kleppe的設想，實驗也成功了。所以Rainbow認為，Mullis可能只是個「追隨者」，並非「開創者」。

Mullis是個「好人」嗎？我們不知道。但是PCR，真真實實地改變了世界。

百變PCR

PCR誕生之後，科學家們迅速意識到了這門新技術的價值，Cetus內部即有學者開始嘗試使用PCR測定血液中的HIV病毒循環量，並很快取得了關鍵的突破[19]。基於這項成果，人們得已對捐獻的血液進行病毒篩查，並直接檢測抗病毒藥物的療效。

這項技術在幾年內得到了極大的發展。基於PCR bug一樣的的擴增能力，從極微量的樣本中提取遺傳信息成為可能。最直觀的應用就是在法醫學上，例如著名的辛普森殺妻案，能夠給犯人定罪就少不了PCR的功勞。

還有考古學，有了PCR就可以從幾萬年前的化石里獲取來自遠古的遺傳信息用於分析，如果將來真的像《侏羅紀公園》那樣重新培育出恐龍，PCR技術一定不會缺席。更近一些，最有名的故事可能是尋回英國國王理查三世遺體的故事了（就是莎士比亞那個理查三世）。

理查三世

理查三世是金雀花王朝的最後一位國王，在玫瑰戰爭的最後一場戰役里，他與自己的士兵一起葬身戰場、匆匆被埋葬，以至於之後的五個多世紀都沒能找回。直到21世紀到來，通過放射性碳測年找到屍骨、與其姐姐女性後代比對線粒體DNA，這才確認了理查三世的屍骨並重新安葬[20]。

在醫療方面，PCR才是真正的改變了世界。產前檢測、組織分型、癌基因突變檢測、診斷傳染病、鑒定微生物……有了PCR的出現，人類以前所未有的速度認識了這個世界，逐漸把生命的真相抓在手中。

結合新出現的事物，PCR還在不斷地出現新的變體。2018年，PCR技術35周歲，而立之年，仍舊大有可為。

下一個35年

如果說PCR有什麼缺點，那麼可能成本是個問題。PCR最關鍵的過程就是熱循環，為了保證精準的溫度變化，昂貴而笨重的設備必不可少，這使得PCR的使用限於實驗室內。

近年來有研究者試圖解決這個問題。他們採用一些更加輕薄、體積更小的薄膜電阻加熱器，取代傳統的熱電裝置，其他結構也選了更加簡單的部件。這種新的名為MiniPCR的系統更小更輕，而且更便宜。

這種設備很適合中等教育需求，一些野外科學家、食品公司都在使用這個系統。最令人驚喜的是，這種設備很適應太空環境，國際空間站的工程師也在使用。

還有些科學家正在試圖讓PCR出現在我們的手機上。Biomeme嘗試把光學感測器安裝到手機上，用APP監控實時定量PCR（RT-qPCR），能夠在線分析數據，並且在手機上實時檢查實驗進度。

用PCR進行微生物檢測也有了新的進展。日本一家乳品公司的科學家正在開發一種基於鈀的試劑，這是一種DNA交聯劑，能夠特異性進入死亡的細菌，防止其DNA的擴增。使用這種技術，PCR可以快速檢測生產的食品中是否含有未被殺死的致病菌[21]。

還有我們最關注的癌症。液滴數字PCR（ddPCR）出現了，它的特點在於PCR反應是在上千個納米級別的液滴中進行的，每個液滴都是單獨的反應池，通過熒游標記來檢測靶序列的含量。這種技術精度更高、需要的樣品量更少，在液體活檢領域可以大顯身手。

而且或許在不久之後，使用PCR可能不需要再重複加熱、退火這個過程了。科學家們已經發現了能夠在恆定溫度下進行DNA複製循環的酶。等溫擴增（LAMP）除了不需使用熱循環儀進行操作，還能夠直接分析新鮮或冷凍血液樣本中的點突變，甚至是紙張上面的干血斑也行，再也不用提取DNA了[22]。

令人激動的時代，令人激動的技術。期待它的下一個35年。

參考資料：

[1] Shampo, M. A.; Kyle, R. A. (2002). "Kary B. Mullis — Nobel Laureate for procedure to replicate DNA". Proceedings. Mayo Clinic. 77 (7): 606. doi:10.4065/77.7.606. PMID 12108595.

[2]https://www.nytimes.com/1998/09/15/science/scientist-at-work-kary-mullis-after-the-eureka-a-nobelist-drops-out.html

[3]http://www.sciencemag.org/features/2018/05/pcr-thirty-five-years-and-counting?_ga=2.214061143.1757775300.1531552304-1663670973.1526261271

[4] Watson JD, Crick FHC, "structure of DNA", natural volume. 171, pp.737-738 (1953).

[5] Lehman, IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A "Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid. I. Preparation of Substrates and Partial Purification of an Enzyme from Escherichia coli" J. Biol. Chem. vol. 233(1) pp. 163–170 (1958).

[6] Khorana HG et al. "Total synthesis of the structural gene for the precursor of a tyrosine suppressor transfer RNA from Escherichia coli. 1. General introduction" J. Biol. Chem. vol. 251(3) pp. 565–70 (1976).

[7] Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG "Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA"s as catalyzed by DNA polymerases." J. Molec. Biol. vol. 56, pp. 341–61 (1971).

[8] Brock TD, Freeze H "Thermus aquaticus, a Nonsporulating Extreme Thermophile" J. Bacteriol. vol. 98(1) pp. 289–297 (1969).

[9]Chien A, Edgar DB, Trela JM "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus" J. Bacteriol. vol. 174 pp. 1550–1557 (1976).

[10] Sanger F, Nicklen S, Coulson AR "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors" Proc Natl Acad Sci vol. 74(12) pp. 5463–7 (1977).

[12]https://www.nytimes.com/1990/07/31/business/cetus-drug-is-blocked-by-fda.html

[13] Saiki RK et al. "Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia" Science vol. 230 pp. 1350–54 (1985).

[14] Mullis KB and Faloona FA "Specific Synthesis of DNA in vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction." Methods in Enzymology vol. 155(F) pp. 335–50 (1987).

[15]https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html

[16]https://www.nytimes.com/1998/09/15/science/scientist-at-work-kary-mullis-after-the-eureka-a-nobelist-drops-out.html

[17] "Hallucinogenic effects of LSD discovered". The History Channel. Archived from the original on March 11, 2014.

[18] Dancing Naked in the Mind Field. 1998, Vintage Books.

[19] Kwok S, etc. "HIV sequences were identified by in vitro enzymatic amplification and oligomeric cleavage." J. Virol. The first volume. 61 (5) pp.1690-4 (1987).

[20] https://en.wikipedia.org/wiki/Richard_III_of_England

[21] T. Soejima, K. Iwatsuki, Appl. Environ. Microbiol. 82, 6930–6941 (2016).

[22] L. Detemmerman, S. Olivier, V. Bours, F. Boemer, Hematology 23, 181–186 (2018).

[23]http://www.sciencemag.org/features/2018/05/pcr-thirty-five-years-and-counting?_ga=2.214061143.1757775300.1531552304-1663670973.1526261271

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