快人一步，從準備三代測序樣本開始

隨著新時代的快速發展，最新研究成果不斷公布，越來越體會到時間就是金錢，效率就是生命。根據我們 PacBio Sequel 平台的項目經驗看，一個項目最主要的卡點，不是建庫，不是上機，不是分析，不是……，最主要的原因是，提取檢測不合格！出人意料嗎？是不是突然感覺抓住了真兇？那麼怎樣解決這個大問題，縮減項目實驗周期呢？我們將不同材料進行分類，按照經驗來準備樣本，盡量減少 DNA 或 RNA 的降解，從根源上降低了樣本浪費，具體過程咱們下面開始詳細介紹~

一、樣品採集

樣本處理原則

1. 杜絕二次處理：凍存過的組織應當保證可以直接進行提取而不需要進行二次處理，二次處理會大大增加樣品 DNA/RNA 降解的風險；

2. 新鮮：不宜使用儲存過久的樣品；

3. 幼嫩：組織須處於旺盛生長期，如菌體的對數生長中後期，植物幼葉、嫩芽或組培苗等，動物血液、肌肉非表皮或老死組織，總之，新生組織最好；

4. 潔凈：組織表面的雜質，無論是培養基還是其他如泥土、不含 DNA/RNA 的部位（如纖維、角質化外殼等），都應該剝離洗凈。RNA 相關的務必注意防止RNAse 污染。

RNA 類

1. 植物組織

取樣：野外獲取的材料需用 DEPC-H2O 沖洗乾淨，並分割成100mg左右的小塊，特別是成團組織（如果實、種子、樹皮、根莖等）經過低溫冷凍後非常堅硬，無法研磨，務必在冷凍前切碎成小塊（不超過綠豆大小），放入1.5mL或者2.0mL加入 RNAlater 的 RNase-free 的 EP 管中，液氮速凍後用封口膜封口。

送樣：乾冰運輸。

2. 動物組織

取樣：活體取材後的組織需迅速用含有 RNase-free 的0.9%生理鹽水漂洗，剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，吸干，並將樣品分割成50mg左右的小塊（組織越小，保存效果越好），放入1.5mL或者2.0mL的 RNase-free 的 EP 管中，並加入 RNAlater 一類的 RNA 組織保存試劑，液氮速凍後用封口膜封口。

送樣：乾冰運輸。

3. 腫瘤組織

取樣：腫瘤組織本身 RNase 較活躍，離體後請立即速凍、分割組織，約2-3mm厚，放入事先裝有 RNAlater 的1.5mL或者2.0 mL RNase-freeEP 管中，液氮速凍後用封口膜封口。

送樣：乾冰運輸。

4. 血液

取樣：常溫條件下收集全血，使用 BD 762165 PAXgene Blood RNA Tube (BD靜脈真空采血管 (全血RNA管)(2.5mL)) 分裝樣品，總送樣量全血5mL，全血新鮮採集後，立即蓋上蓋子，輕輕顛倒8-10次。

送樣：乾冰運輸。

表1 RNA樣本建議送樣量

溫馨提示：對於組織不新鮮或非幼嫩組織等提取困難的樣本類型，建議增加送樣量。

DNA 類

1. 植物組織

取樣：野外獲取的材料需用70%酒精將材料表面沖洗乾淨，吸干，分割成不超過綠豆大小的小塊，放入1.5mL或者2.0mL的EP管後液氮速凍後，放入預冷的50mL離心管或是封口袋中。

送樣：乾冰運輸。

2. 動物組織

取樣：活體取材後的組織需用0.9%生理鹽水漂洗，剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，吸干，並將樣品分割成50mg左右的小塊 (組織越小，保存效果越好)，放入1.5mL或者2.0mL的EP管中，液氮速凍後用封口膜封口，再將EP管放置於50mL離心管中或封口袋中。

送樣：乾冰運輸。

3. 血液

取樣：要求為全血樣本，並加入抗凝劑，推薦使用 EDTA 抗凝的采血管收集樣品 (由於會影響實驗，不能使用肝素抗凝)。

送樣：乾冰運輸。

4. 離體培養細胞

取樣：a）貼壁細胞或懸浮細胞培養結束後，去除培養液；b）用PBS緩衝液快速洗一次，除去PBS緩衝液，貼壁細胞可用細胞刮將其刮下；c）收集的細胞轉入1.5mL的EP管中用封口膜封口後液氮速凍。

送樣：乾冰運輸。

5. 菌體

取樣：a）顯微鏡下觀察細菌生長狀態，收集對數期的細菌；b）將適量體積的菌液轉移至 2mL旋蓋尖底離心管中，於室溫下 14000 r/min離心 1min；c）棄盡培養基，將細菌沉澱迅速置於液氮中冷凍1小時，然後轉移至-80℃或液氮中長期保存。

送樣：乾冰運輸。切記不要寄送菌液和培養皿。

表2 DNA樣本建議送樣量

溫馨提示：對於組織不新鮮或非幼嫩組織等提取困難的樣本類型，建議增加送樣量。

二、檢測標準

圖1 DNA/RNA樣本提取檢測流程圖

表3 合格樣本檢測指標內容

三、檢測不合格原因

RNA 類

1. RIN值偏低、樣品降解

RIN 值是 RNA 完整性的一個指標，RIN 值偏低，表示 RNA 有降解，會影響全長轉錄本的獲取，降低有效數據所佔的比例，造成數據浪費。

處理建議：重新提取或送樣。

圖2 Agilent 2100檢測結果圖

圖3 RNA樣本降解電泳圖

2.OD260/230不合格

OD260/230 是衡量樣品是否含有雜質的指標，OD值不合格，表示樣品可能含有雜質，雜質會影響反轉錄酶的活性及磁珠純化回收率，造成建庫失敗。

處理建議：過柱純化或磁珠純化。

3.濃度不足

Pacbio 官方 Protocol 中第一步反轉錄要求 total RNA 的起始量濃度需要在300ng/μL，濃度偏低會影響反轉錄效率，造成反轉錄失敗。

處理建議：濃縮，樣品濃縮過程中可能會造成樣品降解，RIN 值降低；另外，總量小於3μg的樣品不建議濃縮。

4.特殊樣本類型

海洋生物樣本，可能含有特殊雜質，影響酶活性，造成建庫失敗，上機產出異常。

樣本舉例：海帶、蛙、貝、蛤、蟹、藻類等。

處理建議：根據實際情況確定後續處理方式。

DNA 類

1.樣本降解

動植物DNA樣本可以構建20Kb、30Kb、40Kb的文庫，決定建庫大小的因素是DNA片段的主峰大小，主峰越大越滿足建大片段文庫要求，當片段在20Kb以下時，打斷造成文庫插入片段偏短，會造成數據Insert偏短，數據異常。

處理建議：根據樣品實際情況確定風險建庫或重新送樣。

圖4 DNA降解電泳圖

2.總量不足

建庫最低起始量為10 μg，由於 DNA 建庫過程不進行 PCR，總量不足容易造成純化後出庫庫容偏低，影響文庫產出。

處理建議：補送樣品。

3.雜質污染

蛋白、糖類等雜質會影響接頭連接效率，沒有加上接頭的 DNA，會在酶切純化階段損失掉，造成建庫失敗。

處理建議：過柱純化去除雜質，但純化可能造成樣品降解，並且純化損失率在30%-50%。

圖5 DNA樣本嚴重膠孔污染電泳圖

4.多糖多酚或其它代謝產物含量豐富的組織樣本

有的植物或微生物含有豐富的代謝產物，對 DNA 的純度影響較大，甚至可能導致提取得到的 DNA 溶液過於粘稠，無法純化。

處理建議：對樣本進行暗化處理，直接提供黃化苗等。

5.特殊樣本

真菌、藻類、一些海洋生物提取合格率很低，PCR 樣品本身較為特殊，容易出現上機異常情況。

處理建議：盡量多送樣本嘗試建庫。

以上就是針對利用 PacBio Sequel 平台分別對 RNA 和 DNA 樣本的製備和送樣建議的介紹，是不是對送樣要求有所了解了，想快點發文章，還得從準備樣本開始啊！那還等什麼，趕快送樣吧！

三代測序研究部 史 旺丨文案

王婷婷丨編輯

配圖來源於網路，侵刪

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