磷酸肌醇是HIV-1組裝的輔助因子
撰文丨望夜
責編丨迦漵
人類免疫缺陷病毒（HIV）多年來始終是病毒學的研究熱點之一，HIV相關的結構文章更是生物學頂級期刊的 「常客」。針對HIV的藥物開發，也成為各大製藥公司爭相追捧的「明星」。近日，Nature雜誌在線發表了美國康奈爾大學Volker M. Vogt教授組與弗吉尼亞大學Owen Pornillos教授組合作完成的一項工作【1】，通過結構和功能學研究，確認磷酸肌醇是HIV-1病毒組裝的輔助因子。
磷酸肌醇（Isositol phosphates，IP）是一類單磷酸或多磷酸化的肌醇，具備多種細胞功能，在細胞生長，凋亡、遷移、內吞和分化中發揮關鍵作用。常見的IP分子有IP、IP2、IP3、IP4、IP5、IP6。IP6（inositolhexakisphosphate，肌醇六磷酸，也稱植酸），發現於1903年，是植物組織主要的磷貯存形式，在麩皮和種子中含量較高。IP6分解可產生IP5、IP4、IP3等不同形式。在哺乳動物中，IP6分布廣泛，是含量最豐富的一類磷酸肌醇，依細胞類型和發育階段不同，其濃度在10-40 μM不等【2】。人體中的IP6通常無法從食物獲取，須由肌醇和磷酸分子合成。IP6的一項重要生物學功能是參與DNA修復，在非同源末端連接過程中作為輔助因子【3】。此外，還有報道稱其參與mRNA由細胞核向胞質的轉運【4】，在抗癌（預防和治療）中也能起作用。
具體到HIV-1，早先研究表明Gag蛋白的組裝過程分成兩個階段：初期，由Gag上一段14個氨基酸的間隔多肽1（spacerpeptide 1，SP1）及其後緊鄰的七肽區摺疊成六螺旋束（six-helix bundle）樣結構，促使Gag蛋白聚集成六聚體並進一步裝配成非成熟狀態的六角形柵格（hexagonal lattice）結構；而當Gag被酶切啟動成熟過程後，非成熟柵格解聚，釋放出衣殼結構域（capsid，CA）重裝配成成熟狀態的圓錐樣衣殼。
六螺旋束的摺疊和酶切正是整個組裝和成熟過程的限速步驟【5】，而六螺旋束也已成為HIV-1抑製劑的重要靶點【6】。2016年，Owen Pornillos組在eLife雜誌上報道了非成熟狀態Gag蛋白CA-SP1複合物的晶體結構【7】；同一天，德國萊布尼茨研究所John A. G. Briggs教授組在Science雜誌上發表了使用斷層成像（Tomography）重構的非成熟狀態Gag組裝結構【8】。兩個月前，北京大學生物醫學工程系的陳匡時教授組在PNAS上發表了題為Roles of Gag-RNA interactions in HIV-1 virusassemblydecipheredby single-molecule localization microscopy的研究論文，利用光敏熒光顯微技術研究了HIV-1組裝的動態過程，發現Gag組裝的全程都是病毒vRNA依賴的【9】。
IP6促進HIV-1的組裝也非新鮮事，已有研究稱其與Gag蛋白的MA和NC結構域存在相互作用【10】，本文就是為了回答IP6如何影響Gag組裝。研究者首先構建了包含有CA到NC結構域的一段Gag蛋白（s-CANC）（圖1）。為防止發生自成熟，還將N端多向前額外截取了一個絲氨酸，以干擾成熟組裝所需β-發卡結構的形成。依照前人研究，該構建通常只能在偏酸性（pH 6）條件下形成成熟的病毒樣顆粒（VLP），但他們通過負染電鏡照片觀察發現，在偏酸性（pH 6）和偏鹼性（pH 8）條件下都出現了成熟的VLP（圖1）。但當IP6存在時，可以顯著地誘導球形非成熟狀態VLP的形成，且在偏鹼性時效果更顯著。於是作者推測，IP6具有強制組裝非成熟VLP的能力。
圖1 Gag蛋白不同構建（a）及 IP6促進非成熟VLP的形成（b）【1】。
特異性如何呢？作者進一步測試了不同IP分子（IP3、IP4、IP5）的促進效果，發現它們均可促進s-CANC聚集，且效果隨磷酸基團數目的減少而降低；其他帶負電的有機分子（dNTPs、dATP、檸檬酸、苯六甲酸）卻不具備或僅有極微弱的促進組裝能力。於是推測，可能是其電荷中和效應決定了其對Gag蛋白組裝的作用，幾何和/或空間化學上的協調性也有重要影響。為證明其生物學功能，作者使用CRISPR-Cas9系統構建了肌醇五磷酸激酶（IPPK）敲除的細胞系，用以消除胞內IP6，結果發現感染性病毒顆粒的產量下降了10~20倍。這說明IP6在HIV-1病毒的成熟（或非成熟）組裝中具有關鍵作用。
接下來，結合文獻分析並使用不同的截短體的2D晶體進行電鏡觀察發現，只有在SP1結構域存在時IP6方可誘導組裝成球狀的柵格，說明是SP1結構域和IP6存在相互作用。研究者進一步解析了可組裝的Gag最短構建CACTDSP1與IP6的複合物晶體結構（圖2），發現在CACTDSP1六聚體環形結構內部存在一塊六次對稱的電子密度（即一個Gag六聚體結合一分子IP6），而且此密度剛好與之前報道的冷凍電鏡觀察到的HIV-1非成熟顆粒中 Gag六聚體內部一塊未知的密度吻合。這一直接證據說明IP6是Gag組裝的輔助因子，且是HIV-1顆粒的組分。
圖2非成熟狀態Gag六聚體與IP6的複合體結構【1】
IP6具有多種立體異構體，含量最豐富的為myo-型，呈一個磷酸基豎直狀而另五個磷酸基團水平狀的椅式構象，在已報到的結構中IP6也多呈此構象（圖2f）。在本文的複合物中，IP6也呈myo-型構象，且其直立的磷酸基團指向六螺旋束（6HB）。在結構中，IP6剛好位於兩圈由賴氨酸側鏈構成的環形內部，其一為主要同源區（major homology region）的Lys290，另一個為6HB上的Lys359，它們的ε-氨基與IP6磷酸基團間形成電荷相互作用。
突變實驗顯示，若將賴氨酸突變成丙氨酸，突變體相較s-CANC對IP6的靈敏度降低100倍，說明兩處賴氨酸對於IP6的有效結合都是必需的，而且丙氨酸突變體均失去感染性。即便將賴氨酸突變為精氨酸，突變體較s-CANC對IP6的響應也會受影響，儘管影響沒有丙氨酸突變體嚴重。資料庫統計也顯示兩處賴氨酸位點保守性極高（K290佔99.94%，K359佔99.84%）。由此說明，理想的HIV-1胞內組裝需要這兩處位點均為賴氨酸。
為測試IP6對6HB的穩定作用和其對非成熟Gag六聚體形成的促進作用，研究者使用了全原子分子動力學模擬（all-atom molecular dynamicssimulations），發現在缺失IP6時，CACTDSP1六聚體的六重對稱在200納秒後即被破壞，直到2微妙後仍無法恢復；而在IP6存在時，六重對稱結構，尤其是6HB頂部的IP6結合位點處，一直可以維持。其他IP分子及苯六甲酸（mellitic acid）也可穩定6HB，類似於它們對s-CANC組裝的促進能力。
作者還進一步研究了IP6在成熟衣殼組裝中的作用，該過程是由Gag經酶切後釋放的CA蛋白進行的。結果發現，IP6也可以促進HIV-1 CA組裝成成熟的VLP，只不過所需的IP6濃度（1250 μM）要明顯高於s-CANC組裝時（50-100μM）。且僅有笨六甲酸和IP5具有類似促進作用，而IP4、IP3則無效果。在成熟的CA六聚體中，R18的側鏈也形成一個帶正電荷的環狀。一旦將該精氨酸突變成丙氨酸，IP6即失去促進組裝的能力，且帶有該突變的病毒顆粒也失去感染性。研究者同樣解析了CA六聚體和IP6的複合物晶體結構（圖3），儘管結構中IP6既可以結合於正電荷環的上方，也可以在其下方，但環上方結合位點的電子密度更加清晰，正好位於CA蛋白N端β-發卡包圍所形成的空腔內。因此，IP6也可以結合成熟的HIV-1 CA柵格並促進其組裝。
圖3 成熟狀態的Gag六聚體與IP6複合物結構【1】
基於上述結果，作者總結了IP6對於HIV-1組裝的工作模型（圖4）：IP6通過與兩處賴氨酸側鏈組成的正電荷環相關作用促進CA-SP1六螺旋束的形成，並中和了Gag六螺旋束內部可能形成的同種電荷排斥。儘管其他類似分子也可結合這一口袋區，但本文數據顯示IP6對其組裝的促進作用最顯著，且具有最優的結合幾何空間。大約300-400分子的IP6以一個六聚體對應一個IP6分子的形式結合到病毒顆粒上，成為非成熟狀態Gag殼層的結構組分。而當病毒顆粒成熟時，Gag的六螺旋束結構被酶切破壞，IP6從其上釋放；同一時刻CA蛋白變為成熟構象，暴露出R18結合位點，IP6隨即結合其上，進而促進CA六聚體的形成，並最終形成CA柵格。這類一種小分子在病毒組裝的兩個階段發揮作用的模式，為針對HIV-1複製過程的治療手段開發提供了新的策略。
圖4IP6對Gag組裝的作用模型【1】
今年五月底，eLife上發表過一篇文章【11】，通過結構和功能研究證實了IP6可以穩定衣殼結構，促進衣殼中的逆轉錄過程，起到類似於小RNA病毒（picornavirus）中的口袋因子（pocketfactor）的作用。該文同樣證實了IP6可以整合到HIV-1病毒顆粒中，且每個病毒顆粒包含超過300個IP6分子，同樣鑒定出IP6結合R18位點，極大程度地穩定了衣殼結構，可以說佐證了本文獲得的一些結論。綜合兩篇文章可見，IP6在HIV-1整個生活史中發揮多重關鍵作用，提醒研究者關注相關的脂類分子在病毒感染中的作用。
有趣的是，這篇eLife文章的研究團隊2016年曾經在Nature發文闡釋HIV-1藉助衣殼上的孔洞載入核酸促進衣殼內的DNA合成【12】，此項延續性工作則發表在了eLife上；而本文團隊2016年時的工作僅發表在eLife上。該領域中激烈的競爭可見一斑。但圍繞著HIV-1入侵和釋放仍有諸多未解之謎，相信定有更多精彩故事輪番上演。
圖5IP6分子在HIV-1衣殼上的結合位置【13】
參考文獻
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12. Jacques, D.A., et al., HIV-1 uses dynamic capsid pores to import nucleotidesand fuel encapsidated DNA synthesis.Nature, 2016. 536(7616): p. 349-53.
13. Obr, M. and H.G. Krausslich, The secrets of the stability of the HIV-1capsid.Elife, 2018. 7.
作者介紹
VolkerM. Vogt
康奈爾大學分子生物學和遺傳學系教授，主要研究方向是以勞氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）和禽逆轉錄病毒（prototypic avian retrovirus）為模式研究逆轉錄病毒的組裝，以及HIV組裝相關蛋白的研究。本文的第一作者RobertA. Dick為Vogt教授組助理研究員，該文章創意由他最先提出，為通訊作者之一。
Owen Pornillos
弗吉尼亞大學分子生理學和生物物理學系副教授，本文另一通訊作者。研究方向是HIV及其宿主相關蛋白結構及抗病毒機制研究。本文的結構解析部分由其實驗室完成。
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