劉光慧/李偉/胡寶洋合作組揭示靈長類動物發育和壽命調控的分子開關——專家點評

BioArt按

最近幾年人口統計的數據顯示，中國人口老齡化現象日漸加劇。據民政部發布的《2017年社會服務發展統計公報》顯示，截至2017年底，全國60周歲及以上老年人口超過2.4億人，佔總人口的17.3%，而且五年間，60周歲及以上老年人口激增近25%。衰老是很多慢性疾病的致病因素，這些疾病不僅影響老年人口的生活質量，而且還為社會方方面面帶來沉重的負擔，因此深入研究衰老的過程，尋找可能的衰老乾預手段具有重要的意義。長期以來，科學家主要以酵母、線蟲、果蠅、鼠等模式生物開展衰老生物學研究。然而由於人類可能在許多方面和上述模式生物存在較大的差異，因此尋找合適的靈長類動物進行衰老相關研究意義重大。今日，來自中國科學院幹細胞與再生創新研究院等機構合作發表在Nature上的研究成果，運用SIRT6基因敲除的食蟹猴模型為人類發育和衰老相關疾病提供新的範式。有鑒於此，BioArt特別邀請到了昆明理工大學靈長類轉化醫學院院長、雲南中科靈長類生物醫學重點實驗室季維智院士，HHMI研究員、美國貝勒醫學院王萌教授以及中科院上海神經所楊輝研究員對該工作進行了點評，以饗讀者！

點評丨季維智、王萌、楊輝

責編丨迦 漵

衰老（Aging）是機體生理功能隨時間逐漸退化的過程，是神經退行性疾病、動脈粥樣硬化、糖尿病和惡性腫瘤等慢性疾病的最大風險因素【1】。衰老進程主要由遺傳和表觀遺傳因素共同調控【2】，因此理解衰老的遺傳和表觀遺傳基礎是延緩衰老和防治衰老相關疾病的重要前提。

早在1999年，人們就發現Sir2基因具有延長釀酒酵母壽命的作用，因此被稱為「長壽基因」【3】，隨後還有研究表明在線蟲或果蠅中過表Sir2基因也會增加壽命【4，5】。在嚙齒類動物中，Sir2的同源基因SIRT6也被認為參與了衰老及壽命的調控：過量表達SIRT6能夠延長雄性小鼠的壽命，而敲除SIRT6則會使小鼠表現出皮下脂肪減少、脊柱彎曲和變形、骨密度降低、腸道上皮受損、端粒縮短等加速衰老的表型，且小鼠壽命縮短至約1個月【6】。由於SIRT6在功能上鏈接著表觀遺傳穩態、基因組穩定性和代謝調控，因此SIRT6被認為是經典的「長壽蛋白」，並成為人們試圖延緩衰老的重要靶標。然而，迄今為止幾乎所有SIRT6作為「長壽蛋白」的證據均來源於小鼠和其他低等模式生物，而SIRT6能否在靈長類動物中發揮類似的功能尚不清楚。

北京時間8月23日凌晨，中科院生物物理研究所劉光慧課題組與中科院動物研究所周琪院士團隊、李偉課題組以及胡寶洋課題組等合作在Nature上發表了題為SIRT6 deficiency results in developmental retardation in cynomolgus monkeys的研究成果，首次實現了SIRT6在非人靈長類動物中的全身敲除，獲得了世界上首例特定長壽基因敲除的食蟹猴模型。

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得SIRT6全身敲除的食蟹猴

來自中國科學院生物物理研究所和動物研究所的研究團隊聯合攻關，經過三年的不懈努力，首次實現了SIRT6在非人靈長類動物中的全身敲除，獲得了世界上首例特定長壽基因敲除的食蟹猴模型。與SIRT6敲除小鼠表現的加速衰老表型明顯不同，SIRT6敲除的食蟹猴在出生數小時內即死亡。多項分析結果顯示，SIRT6敲除的食蟹猴未見加速衰老表型，卻表現出嚴重的全身發育遲緩。新生SIRT6敲除猴的腦、肌肉及多種其他器官組織均表現出明顯的胚胎期未成熟的細胞和分子特徵。此外，利用人類幹細胞模型開展的研究表明，SIRT6缺乏也可阻滯人類神經幹細胞向神經元的分化。進一步的分子機制研究發現，SIRT6可以通過介導長鏈非編碼核糖核酸H19印記調控區的組蛋白去乙醯化來反式抑制H19的表達，而SIRT6的缺乏則會在靈長類動物神經前體細胞中引起H19表達的異常上調，進而導致腦發育遲緩。

SIRT6缺失導致lncRNA H19表達上調，從而延緩腦發育。

該研究首次結合非人靈長類動物模型、人類幹細胞模型及基因編輯技術揭示了可調控靈長類動物出生前發育程序的關鍵分子開關，為研究人類出生前發育遲緩綜合征提供了重要的模型體系。此外，該研究首次揭示了靈長類和嚙齒類動物在衰老調節通路方面的巨大差異，為開展人類發育和衰老的機制研究，以及相關疾病的干預奠定了重要的基礎。

據悉，該研究工作由中國科學院生物物理研究所、中國科學院動物研究所、首都醫科大學宣武醫院、北京大學附屬第一醫院、和中山大學等機構合作完成。中國科學院生物物理研究所劉光慧研究員、中國科學院動物研究所李偉研究員和胡寶洋研究員為論文的共同通訊作者。中國科學院生物物理研究所張維綺研究員，中國科學院動物研究所萬海峰助理研究員、馮桂海副研究員和曲靜研究員為共同第一作者。周琪院士對工作的開展給予了重要的指導和支持。

研究團隊合影

專家點評

季維智（中科院院士）、陳永昌（昆明理工大學教授）

保持健康和長壽是人類世世代代的追求，為了「長生不老」，《西遊記》中各路妖魔鬼怪誤以為吃了「唐僧肉」就可長生不老。全世界的科學家們也始終圍繞「提高生活品質、改善健康水平」為主題不斷探究生命發生髮展的內在機制。目前已發現了大量與遺傳及表觀調控相關的「長壽」因子。如Sir2基因已被證實是嚙齒類動物的「長壽基因」。

為了探索該基因在靈長類（人和非人靈長類）是否具有延年益壽的功能，中國科學院的科學家團隊合作將Sir2在靈長類的同源基因SIRT6在「大師兄」（猴）上進行了遺傳操作，利用CRISPR/Cas9系統，通過優化篩選，高效地將該基因進行了敲除，獲得3隻出生及1隻流產的食蟹猴模型材料。猴子出生後均在數小時內死亡，符合「出生前發育遲緩綜合征」的特點。研究團隊隨後做了細緻的基因型及病理表型分析，以及分子、細胞及組織水平的研究，發現SIRT6敲除的新生猴在個體大小、腦發育、肌肉、脂肪、腸道等方面僅相當於2-4月齡正常胎猴的發育水平（正常猴懷孕期為165天左右）。RNA-seq及基因組範圍DNA甲基化分析進一步探討了導致發育遲緩的內在機理。

該研究是首次利用非人靈長類通過基因編輯建立的SIRT6基因敲除猴模型，為深入探討人類長壽及早衰等相關疾病提供了可靠信息。

王 萌（貝勒醫學院教授，HHMI研究員）

Sirtuin自從在酵母的工作中和衰老調控鏈接在一起，一直是衰老研究領域的熱點分子。Sirtuin是一類煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴的去乙醯化酶，其核心區域高度保守，部分成員還兼具ADP核糖基轉移酶的活性。2006年，Mostoslavsky等人首次報道了SIRT6在小鼠衰老過程中的作用。SIRT6基因敲除小鼠出生時與野生型小鼠基本無異，但兩周後，SIRT6敲除小鼠開始表現一系列早衰特徵，包括皮下脂肪顯著減少、脊椎彎曲和變形、骨量減少及骨密度降低等，也伴隨著端粒縮短和基因組不穩定增加等衰老的分子特徵。

劉光慧組等最近發表在Nature上的合作研究報道了SIRT6在靈長類動物發育衰老中作用。他們發現，SIRT6缺乏會將食蟹猴的發育時鐘撥慢一倍，導致嚴重的子宮內發育遲緩，而足月出生的SIRT6缺乏食蟹猴如同嚴重早產的胎猴，並於出生數小時內死亡。通過對腦、肌肉、脂肪、骨骼、肺、肝和腎等多種組織以及原代分離的間充質幹細胞的表型分析，他們印證了SIRT6缺乏只是引起了多器官發育進程的阻滯，而並不導致組織細胞的加速衰老。這些結果非常出人意料，表明對於嚙齒類動物和靈長類動物的發育和衰老，SIRT6的調控作用存在著巨大的差異。

那SIRT6是如何來調節食蟹猴的發育的呢？藉助多組織的生物測序分析，他們發現，SIRT6通過調節印記基因LncRNA-H19的表達來調控出生前的發育進程。H19是最早發現的印記基因之一，作為一種母源印記基因，H19在胚胎期高表達，而在圍產期表達下降。之前的研究表明，H19表達增加將導致一種罕見的人類先天疾病，患兒主要表現為身材矮小、子宮內發育遲緩，這些表型與SIRT6缺乏食蟹猴非常相似。

為了證明新發現的H19調節方式也存在於人體細胞中，及其作用機制，作者進一步通過TALEN介導的基因編輯建立了SIRT6敲除的人胚胎幹細胞體系，並將之分化為神經前體細胞和神經元。基於這一模型，他們發現H19的表達受到上游ICR區的表觀狀態調控，而SIRT6正是通過結合於這一區域，催化其底物組蛋白H3K56的去乙醯化，促進H19的表達關閉，來介導神經前體細胞正常的分化和發育。SIRT6的缺失會造成這一區域H3K56乙醯化水平的異常增加，H19的表達無法正常關閉，從而阻礙了神經前體細胞向成熟神經元的分化。

因此，通過結合基因編輯、靈長類動物模型和人的幹細胞模型，研究人員系統的揭示了SIRT6這個衰老領域的熱點分子，對靈長類的發育調節起著至關重要的作用， 以及SIRT6調節靈長類動物H19表達的全新機制。值得一提的是，就在該文章上線前不久，Mostoslavsky等人報道了攜帶SIRT6酶活缺失單點突變的人類胚胎（2018，Gene & Dev）【7】，這些胚胎均停滯於妊娠中後期，其子宮內發育遲緩的表型與SIRT6缺失的食蟹猴的表型高度一致。這篇文章揭示了靈長類動物模型對於研究人類衰老調節機制的重要作用，為研究人類發育和衰老相關疾病提供新的範式。

楊 輝（中科院上海神經所研究員，「青年千人」）

使用進化上接近人類的非人靈長類（如猴類）來構建腦認知和腦疾病研究的動物模型（如孤獨症，抑鬱症，帕金森病阿爾茲海默症等）已經成為國際神經科學界的最重要的前沿問題之一。而張維綺等從另一個方面解析了非人靈長類基因修飾模型的重要作用：傳統的嚙齒類動物模型不一定能真實反應該基因在人類中的作用。與SIRT6敲除小鼠表現的加速衰老表型明顯不同，SIRT6敲除的食蟹猴在出生數小時內即死亡。多項分析結果顯示，SIRT6敲除的食蟹猴未見加速衰老表型，卻表現出嚴重的全身發育遲緩。更為重要的是，最近的一項研究顯示，4例攜帶SIRT6 187G>C點突變的胎兒在圍產期死亡（17周-35周），其表型與缺失SIRT6的食蟹猴相似【7】。 值得一提的是，他們採用多個sgRNA方法，在短短半年時間就能得到基因功能完全敲除的猴，這一方法在我們以及其他幾個實驗室的工作中都有證明。這說明，做非人靈長類實驗並不一定都需要等待漫長的時間，這將進一步促進更多的學者加入到非人靈長類的研究中去。

參考文獻

1、López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., & Kroemer, G. (2013). The hallmarks of aging.Cell, 153(6), 1194-1217.

2、Pal, S., & Tyler, J. K. (2016). Epigenetics and aging.Science advances, 2(7), e1600584.

3、Kaeberlein, M., McVey, M., & Guarente, L. (1999). The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.Genes & development, 13(19), 2570-2580.

4、Tissenbaum, H. A., & Guarente, L. (2001). Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans.Nature, 410(6825), 227.

5、Rogina, B., & Helfand, S. L. (2004). Sir2 mediates longevity in the fly through a pathway related to calorie restriction.Proceedings of the National Academy of Sciences, 101(45), 15998-16003.

6、Kanfi, Y., Naiman, S., Amir, G., Peshti, V., Zinman, G., Nahum, L., ... & Cohen, H. Y. (2012). The sirtuin SIRT6 regulates lifespan in male mice.Nature, 483(7388), 218.

7、Ferrer, C. M., Alders, M., Postma, A. V., Park, S., Klein, M. A., Cetinbas, M., ... & Mannens, M. M. (2018). An inactivating mutation in the histone deacetylase SIRT6 causes human perinatal lethality.Genes & development.

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