一作解讀：當光遺傳學結合雙光子熒光顯微成像應用於非人靈長類大腦皮層
近日，北京大學生命科學學院唐世明課題組於PLOS Biology在線發表題為「Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates」的文章。
該研究利用光遺傳學和雙光子熒光顯微成像技術，首次報道了具有單細胞精度和長時程穩定性的全光學手段（AOI）在非人靈長類大腦皮層的成功應用案例。
接下來，本文第一作者、生命科學學院2015級博士研究生居年盛為您帶來更為細緻的解讀。
背景
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光遺傳學
廣義上來說，通過遺傳學手段在特定類型神經元中表達效應器後利用光來改變神經元的活動被稱為光遺傳學。
微生物視蛋白作為一種光感蛋白，因其簡單、高效和通用性高，成為目前最常用的光遺傳學效應器。在特定波段光的照射下，視蛋白結構發生改變，便作為離子通道允許特定類型的離子跨膜流動，最終導致神經元膜電位的變更，從而引起對神經元的激活或抑制作用。
以當下影響最為深遠、應用最廣泛的視蛋白channelrhodopsin-2（ChR2）為例，其自身作為一種陽離子通道，在藍光的照射下通道打開使得鈉離子內流、鉀離子外流，導致膜電位去極化從而令神經元興奮。
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「光遺傳學」這一專有名詞於2006年被正式提出。
在至今十年多的時間裡，具有高空間、時間解析度的光遺傳學手段被廣泛應用於神經元群體和神經迴路的功能研究。
同時，藉助遺傳學工具的發展，光遺傳學可以實現對特定類型神經元的高效操控，極大促進了特定類型神經元的功能研究。
總的來說，這些手段對我們理解神經迴路如何工作以及它們如何控制行為有著重要意義。
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圖 1
A. 興奮性和抑制性光感蛋白（圖片來自網路）；
B. ChR2的光控效果圖 （引自Boyden et al., 2005Nature Neuroscience） ；
C. 光遺傳學應用於小鼠深腦核團的刺激（引自Scanziani et al., 2009Nature）。
雙光子熒光顯微成像
雙光子熒光顯微成像技術是目前廣泛使用的在體光學成像技術。當兩個長波長光子被熒光團同時吸收，熒光分子由基態躍遷至激發態從而溢出熒光。雙光子成像過程中，僅焦平面的光子密度足夠激發熒光分子，因而無需針孔裝置進行聚焦，使得成像質量相比於共聚焦顯微鏡有明顯提升。
在近三十年的發展歷程中，雙光子成像技術不斷成熟和完善。相比於傳統的電生理記錄手段，雙光子成像可以實現在單細胞、單數突精度上對神經元群體活動的監控。受限於固定難度和遺傳學差異，雙光子成像的應用對象多為個體較小的實驗動物，包括小鼠、樹鼩、果蠅等。
本課題組經過多年的摸索和嘗試，近期成功在清醒獼猴的大腦皮層實現高效、穩定的雙光子成像（Li et al., 2017,Neuron）。
獼猴作為非人高等靈長類動物，同人有更高的同源性，在行為、大腦結構和功能上更為接近，對神經疾病和高等認知功能的研究有著重要的意義。
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圖 2
A. 雙光子激活原理示意圖（圖片來自網路）；
B. 雙光子成像下的獼猴初級視覺皮層朝向Pinwheel結構圖（引自 Liet al., 2017,Neuron）；
C. 雙光子成像與同步電生理記錄（引自 Liet al., 2017,Neuron）；
D. 不同尺度上的雙光子成像示意圖（引自Scanziani et al., 2009Nature）。
結合光遺傳學和雙光子成像的全光學手段（AOI）
AOI一方面利用光遺傳學改變神經元的活動狀態，另一方面通過鈣指示劑和雙光子成像同步記錄神經元的活動，實現了以非侵入性損傷的方式實現對目標神經元群體的重複性操控和監視。
應用AOI可以對神經元群體進行重複性、低損傷的單細胞操作，推動著神經迴路的精確功能測繪。
高效、高精度的AOI目前已被報道可以在小鼠的大腦皮層上實現（Rickgauer et al., 2014Nature Neuroscience, Packer et al., 2015Nature Method），但非人高等靈長類動物大腦皮層的AOI技術仍有空缺。
基於本實驗室成熟的非人靈長類大腦皮層雙光子成像平台（Li et al., 2017,Neuron），我們近日成功在獼猴初級視覺皮層進行高效、穩定的AOI操作並於PLOS Biology學術期刊在線報道。
簡介
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本文報道了長時程、高效的AOI在獼猴大腦皮層的首次成功應用。
在攻克了阻礙單光子、雙光子光遺傳學刺激和雙光子成像在清醒獼猴大腦皮層上結合應用的困難後，我們成功實現在長達6個月的時間內對同一神經元和神經元群體的穩定操控和記錄。重複的光遺傳學刺激在獼猴初級視覺皮層引起高度一致的神經元活動，並引起可靠的視覺感知。在本文行為學任務下，獼猴經由光遺傳學獲得的視覺感知與視覺刺激帶來的感知相當。
本次進展對高等靈長類動物特有的神經迴路機制的研究有積極幫助，同時為人類神經疾病的光遺傳學治療提供了臨床前測試的重要參考。
研究內容
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單光子光遺傳學操控和同步雙光子成像
我們首先在獼猴初級視覺皮層（V1） 轉染了光遺傳學蛋白C1V1和鈣信號探針GCaMP5G/GCaMP6s。
經過6周時間的表達後，我們在皮層表面安裝用於光激活和雙光子成像的光學窗口。由於C1V1-ts-eYFP的膜定位特性，雙光子成像下神經元胞體呈黑洞狀。神經元靜息狀態下，GCaMP6s熒光相對較弱。
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為檢測光激活的效率，我們用532 nm的單光子激光對成像視野內的神經元群落進行重複激發。
在重複的激光照射下，各神經元的神經活動具有高度的一致性。與視覺刺激（移動光柵和顏色塊）進行對比，同一神經元在視覺刺激和光激活下產生的神經活動幅度相當。
通過調整所用激光的光強，我們記錄到強度低至0.8 mW/mm2的激光便足以引起高效的神經活動。
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圖3
A. 獼猴V1神經元在表達C1V1-ts-eYFP和 GCaMP6s後的雙光子圖像；
B. 視覺刺激下神經元群體的反應；
C. 光刺激下神經元群體的反應；
D. 兩個示例神經元在光刺激和視覺刺激下的反應曲線；
E. 神經元群體在光刺激和視覺刺激下的反應強度對比；
F. 神經元群體在光激活下的重複性統計；
G. 神經元群體平均反應強度與激光強度的關係。
長時程穩定性
通過AOI，我們嘗試評估轉基因表達水平和神經元群體在光刺激和視覺刺激下反應強度的長時程穩定性。
實驗結果顯示，在長達6個月甚至更長的時間內，獼猴V1基因表達水平和光激活下神經元的反應維持穩定。
同時，經視覺刺激檢驗，V1神經元的反應特性在這段時間內不受影響，仍有著正常的生理特性。
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圖 4
A. V1腦區在轉染後第204天（Day 204） 和第292天（Day 292） 的雙光子圖像；
B. 視覺刺激下Day158/Day 292神經元群體的反應；
C. 光刺激下Day158/Day 292示例神經元的反應曲線；
D. 視覺刺激下Day158/Day 292示例神經元的反應曲線；
E. 皮層不同深度的轉染效果圖；
F. 皮層不同深度神經元在光刺激下的反應強度；
G. 光激活實驗中Day158/Day 292平均圖像；
H. 光激活下Day158/Day 292神經元群體反應強度對比；
I. Day 158/Day 292神經元群體偏好朝向對比。
單細胞精度的光激活和同步雙光子成像
解析神經迴路功能的一個有效手段是在激活單個神經元情況下同步記錄該神經元所連接神經元的活動。
為了實現同步的單細胞精度光激活和神經元群落雙光子成像，我們在現有的光路中加入了另一路鎖模飛秒激光（1070 nm, 50 fs），並通過雙光子螺旋掃描來激活目標神經元。
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為了檢驗單細胞雙光子光激活的空間精度，我們以目標神經元為中心排列了5x5等間距分布（20 μm）的激活點陣，當且僅當螺旋掃描線位於目標神經元胞體處時，該神經元被激活。
進一步，我們同時瞄準一片成像區域內的多個目標神經元並按順序進行光激活操作。每個目標神經元當且僅當在被雙光子螺旋線瞄準時產生較強的反應。
圖 5
A. 共表達GCaMP5G和C1V1的神經元和光激活點陣；
B. 雙光子光激活下神經元的反應曲線；
C. 光激活位置在神經元胞體和四周的反應曲線對比；
D. 另三個示例神經元在雙光子光激活下的反應曲線；
E. 多個共表達GCaMP5G和 C1V1的神經元和光激活點陣；
F. 雙光子光激活下神經元的反應曲線；
G. E中目標神經元在雙光子光激活下的反應曲線。
光遺傳學對行為的操控
為評估光刺激V1神經元群體所引起的感知，我們設計了一個名為」GO」/」NO GO」的視覺感知任務。
在該任務中，獼猴需要用眼動來報告周邊視野中短暫出現的視覺提示。
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在」GO」實驗中，我們首先用一個0.5度的高斯白點作為視覺提示，呈現在注視點周圍三度左右的視野中。
獼猴首先盯住中心注視點開始實驗，視覺提示在一段隨機的時間段中出現，當且僅當獼猴在提示消失的500 ms時間內做出掃視動作方可得到果汁獎勵。
在」NO GO」 實驗中，無視覺提示出現，獼猴需要保持注視中心注視點2000 ms以得到果汁獎勵。
經過訓練，獼猴在該任務下有超過80%的正確率。而且，在沒有要求眼動掃向提示區域的情況下，獼猴的眼動均一致導向提示出現區域。
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我們接下來用光遺傳學刺激代替視覺刺激進行相同的實驗，即通過光激活V1腦區（1 mm2, Opto Stim）來檢測獼猴是否能接收到視覺感知。
為了使實驗更加嚴格，我們增加了一個嚴格的對照實驗。在該對照中，我們將激光導向光學窗口中另一片未表達C1V1的腦區（Mistargeted Stim）。
經過一段適應期（獼猴在Opto Stim下表現出高度一致的眼動響應，而且眼動導向的區域正是目標腦區在視覺拓撲投射下對應的視野區域。Mistargeted Stim下未表現出明顯的眼動。
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圖 6
A. 行為學任務示意圖；
B. 激光位置導向裝置；
C. 行為任務正確率統計圖；
D. 視覺刺激下的眼動軌跡統計圖；
E. 光刺激下的眼動軌跡統計圖。
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接下來，我們對視覺刺激和光刺激下眼動的時間延遲做了統計分析。
實驗結果顯示，兩隻獼猴在光刺激下的眼動反應均比視覺刺激下的快了約30 ms。這一結果與早期研究中報道的視覺信號從視網膜傳至初級視覺皮層所需的時間吻合。
綜合這些行為學結果，光刺激能給獼猴帶來與視覺刺激相當的感知，從而也印證了本研究中光遺傳學激活手段的高效性。
引用文獻
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1. Boyden ES,Zhang F, Bamberg E, Nagel G, Deisseroth K. Millisecond-timescale,genetically targeted optical control of neural activity.NatNeurosci.2005;8(9):1263–8.
2.ScanzianiM, H?usser M. Electrophysiology in the age of light.Nature, 2009,461(7266):930-939.
3. Li M, Liu F,Jiang H, Lee TS, Tang S. Long-Term Two-Photon Imaging in AwakeMacaque Monkey.Neuron.2017;93(5):1049–57 e3.
4. Packer AM, Russell LE, Dalgleish HW, Hausser M. Simultaneousall-optical manipulation and recording of neural circuit activitywith cellular resolution in vivo.Nat Methods.2015;12(2):140–6.
5. Rickgauer JP,Deisseroth K, Tank DW. Simultaneous cellular-resolution opticalperturbation and imaging of place cell firing fields.Nat Neurosci.2014;17(12):1816–24.
6. Denk W,Strickler JH, Webb WW. Two-photon laser scanning fluorescencemicroscopy.Science.1990;248(4951):73–6.
7. Chen TW,Wardill TJ, Sun Y, Pulver SR, Renninger SL, Baohan A, et al.Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.Nature.2013;499(7458):295–300.
課題組介紹
唐世明：
北京大學生命科學學院研究員、博士生導師
獲第九屆中國青年科技獎
入選新世紀「百千萬人才工程」國家級人選
獲國務院政府特殊津貼
研究成果入選「2005科學發展報告」（共10項突破性成果）
2005年獲國家傑出青年科學基金
「科學中國人2004年度人物」
研究成果「果蠅的視覺不變性」入選2004年中國科學家十大發現
實驗室研究領域:
研究背景：腦認知與人工智慧
如果你想要理解大腦認知的原理、想要突破人工智慧，或者說想要構建一個物理系統，使之能像大腦一樣感知和思考，應該從哪裡入手呢？
廣義上講，大腦是一個計算系統，它大概是由不太複雜但數量龐大的計算單元（神經元）組成的。雖然在發育關鍵期，外部刺激對大腦神經網路布線有重要影響，但外部刺激和學習記憶應該不是決定性的因素。
通過複雜的刺激訓練，並不能使一個規模龐大、但結構簡單的神經網路自動產生多少智能。事實上，億萬年緩慢的生物演化，使大腦具有複雜的網路初值，這應該才是智能的關鍵。
如果我們還沒有能力設計出一種比自然演化更高效的演算法，自動搜索出智能系統，也沒有足夠高的智慧或者足夠好的運氣，直接設定智能系統的初值，那麼，從神經生理層面，研究真實大腦的神經線路，將是值得考慮的做法。
視覺認知：
最初級的智能起始於感覺系統，人腦信息輸入有超過80%來自視覺，腦認知的內部運作也主要基於視覺概念。
視覺認知主要功能是識別，另一個則是空間定位，這對應於生理學上的What和Where通路。視覺系統的智能體現在視覺不變性，偏離注視點或者大小不同的同一個客體，均能被視覺系統準確快速地識別，而這些視覺客體在視網膜甚至是初級視皮層上的激活區都發生了很大的變化，這也是理解視覺識別的最大障礙之一。
知覺不變性對應了思維的基本元素——概念，進而也是大腦構建知識系統及產生智能的基石，就像是底層的操作系統和彙編語言，雖然艱澀難懂，但卻是最終理解腦認知不能迴避的問題。
研究方向：
1960年代Hubel和Wiesel的發現或許已經解答了一條簡單的線段是如何被識別出來的，即：對於可能出現在各個位置的、不同朝向的線段，大腦都預製了對應的檢測細胞。
這種簡單策略在識別稍微複雜的圖形的時候就會遇到困難，我們或許可以設想大腦預製了針對兩條線段組合的細胞，那麼三條線段或者更為複雜的圖形又該怎麼辦呢？不幸的是，現實中的圖形大多都比線段複雜，識別輪廓中局部線段的朝向，那只是個開始。
真正的挑戰在於，視覺系統是如何利用這些分散的朝向信息，識別出一個完整的圖形。
我們研究那些比bar稍微複雜一點的圖形，例如一條比bar長一點的線段，是如何被大腦識別出來的，進而了解視覺認知最基本的原理。
為此，我們建立了先進的視覺認知行為和神經生理學實驗平台，採用電極陣列、光學成像、分子生化、雙光子等研究技術，探測視覺皮層複雜的神經線路，研究視覺系統如何同時產生形狀識別的選擇性和不變性。
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