化療與腫瘤免疫原性細胞死亡

化療與腫瘤免疫原性細胞死亡

羅聰陶寧

國際腫瘤學雜誌, 2017,44(05) : 369-372.

化療抵抗限制了化療療效，對於複發患者往往束手無策。近年來，抗腫瘤免疫取得了較大進展，人們逐步認識到抗腫瘤免疫的重要性，免疫治療如PD-1抗體、嵌合抗原受體療法(CART)等有望成為第4種腫瘤治療方法，免疫治療更是被Science評為2013年年度重大科學突破[1]。然而CART目前主要是針對B淋巴細胞白血病，PD-1抗體也只是對部分腫瘤有效，尚存在一定的局限性，特別是腫瘤負荷過重的患者。化療在解除腫瘤負荷方面具有一定優勢，而抗腫瘤免疫因為T細胞受體多樣性帶來的高度適應性對於解決耐葯問題具有獨特優勢，那麼化療與抗腫瘤免疫之間是否有協同作用，是一個受到高度關注的問題。

1　某些化療藥物發揮作用與免疫效應

傳統觀念認為化療通過細胞毒作用殺傷腫瘤細胞。腫瘤細胞生長旺盛，相對於一般組織細胞而言，腫瘤細胞往往需要攝取更多的物質供應其生長，因此，更多的化療藥物進入腫瘤細胞，發揮殺傷效應，這是化療藥物差異殺傷的基礎。該觀點的一個重要證據是同樣生長旺盛的組織細胞會產生較大的毒性作用，例如頭髮毛囊細胞、胃腸道上皮細胞、造血器官，因此化療藥物常見的不良反應包括脫髮、嘔吐、骨髓細胞受損，特別是後者，將導致貧血及免疫細胞減少等嚴重不良反應。然而，多項研究表明，化療抗腫瘤需要免疫系統參與，而且一旦誘發了腫瘤免疫原性細胞死亡(immunogenic cell death，ICD)後，腫瘤內細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)/Treg的比例上升，患者預後良好，反之亦然，目前的研究數據集中於乳腺癌和結腸癌[2,3,4,5]；Meta分析顯示，實體瘤化療後，淋巴細胞嚴重減少者預後不良；動物荷瘤實驗(包括移植瘤和化學物誘導原發瘤)結果顯示，化療效果在野生型與免疫缺陷型小鼠組間差異有統計學意義[6,7]。

2　T細胞免疫與化療起效

有研究發現，使用化療藥物(環磷醯胺)後，小鼠腫瘤消退，而採用CD4抗體、CD8抗體或CD3抗體清除小鼠體內的T細胞，小鼠腫瘤生長速度與未使用化療藥物的對照組小鼠沒有區別。另外，在缺乏T細胞的裸鼠中使用化療藥物，同樣無法抑制腫瘤的生長，而在野生型小鼠中使用同等劑量的化療藥物，腫瘤有明顯的消退，充分說明化療需要機體T細胞的參與。採用干擾素(interferon，IFN)-γ受體基因敲除小鼠進行上述實驗發現，使用化療藥物無法抑制腫瘤生長，說明IFN-γ參與T細胞抗腫瘤效應。

3　某些化療藥物誘導ICD與特異性抗腫瘤免疫3.1　ICD發生的必需條件

ICD的發生需要兩個條件[8]：①在體外，腫瘤細胞可被ICD誘導劑(化療葯)殺死，並且在沒有任何佐劑的條件下，該腫瘤細胞可引發免疫反應，並保護小鼠在隨後注射活的腫瘤細胞時產生保護性的免疫反應，不成瘤或者腫瘤更小；②在體內，ICD可激發局部免疫反應，並招募初始免疫效應細胞進入局部癌灶，並抑制腫瘤生長，且這種抑制效應依賴(至少部分依賴)免疫系統。通過基因敲除或者抗體中和試驗，發現參與ICD的免疫系統成分包括Casp1[8]、CXCR3、IFN-γR、IFN-γR1、白細胞介素(IL)-1R、IL-17、Toll樣受體(TLR)4、Ly96(TLR4適配體)、Myd88(TLR4適配體)、Nlrp3、P2rx7(嘌呤受體)、Prf1(穿孔素)。此外，裸鼠實驗和重症聯合免疫缺陷小鼠實驗證明免疫系統對於ICD具有重要意義，在這兩種小鼠中化療葯不能誘導腫瘤細胞產生疫苗樣反應，而且化療葯抗腫瘤效果為無效。

3.2　ICD與病毒誘導免疫反應的類似之處

研究發現，蒽環類化療葯通過激活腫瘤細胞TLR3引起Ⅰ型IFN的快速產生。通過與腫瘤細胞的IFN-α和IFN-β受體(IFNAR)結合，Ⅰ型IFN可以通過自分泌和旁分泌的方式引起趨化因子(CXCL)10的釋放。若腫瘤缺乏TLR3或IFNAR，那麼將導致化療失敗，若人為補充Ⅰ型IFN或CXCL10，則化療重新起效。而且，在乳腺癌預後不佳的幾項相互獨立的隊列研究中發現，Ⅰ型IFN相關信號可以預測蒽環類化療葯的治療效果。該研究還提示蒽環類化療葯介導的免疫反應模擬了病毒引起的免疫反應，研究者認為這種"病毒模擬"的現象可以作為化療有效的一種標誌[9]。

3.3　高遷徙率族蛋白B1與TLR4結合與誘導腫瘤特異性T細胞激活

研究發現放化療引起腫瘤細胞死亡，後者釋放出高遷徙率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)，該分子是一種晚期炎症介質，可發揮預警作用，通過樹突狀細胞(DC)的TLR4受體及MyD88信號通路引起腫瘤特異性T細胞激活，發揮免疫殺傷效應。在乳腺癌小鼠模型中，HMGB1－/－、TLR4－/－、MyD88－/－小鼠體內，放化療的抗腫瘤效應都將減弱，同時在流行病學調查中發現，高加索人中有8%～10%攜帶Asp299Gly，攜帶該基因型別的乳腺癌個體對放化療的效果弱於普通人群。研究發現該型別的TLR4會降低HMGB1與TLR4的相互作用，而且會阻斷死亡黑色素瘤細胞通過DC激活Mart1特異性-HLA-A2限制性-CTL，因為該激活過程依賴HMGB1作用於DC。研究者認為放化療誘導的抗腫瘤免疫的形成需要兩個關鍵點，即死亡腫瘤細胞發出兩個信號：鈣網蛋白(calreticulin，CRT)的暴露("吞噬我"的信號)和HMGB1釋放("危險"信號)，進而引起DC對抗原的攝取及TLR4依賴的抗原呈遞，兩個信號缺一不可。

3.4　化療藥物誘導ICD過程中的自噬

研究者發現化療藥物引起腫瘤細胞發生ICD過程中，自噬發揮重要作用。一般情況下，腫瘤細胞並不發生自噬，而化療葯可導致腫瘤細胞發生自噬，垂死的腫瘤細胞釋放出三磷酸腺苷(ATP)，相當於"發現我"的信號，招募DC和T細胞進入腫瘤局部，引起腫瘤細胞發生ICD。若採用自噬抑製劑，可抑制垂死的腫瘤細胞釋放ATP，在自噬缺陷腫瘤細胞株中，抑制細胞外ATP降解酶，提高胞外ATP濃度，可重新招募免疫細胞，恢復化療葯的治療效果[7]。

3.5　甲醯肽受體1與DC成熟

腫瘤內的DC驅動的抗腫瘤免疫有助於蒽環類藥物的抗腫瘤效果，DC與腫瘤細胞的接觸與甲醯肽受體1(formyl peptide receptor 1，FPR1)有關。

研究者對兩項獨立乳腺癌隊列研究中患者的DNA進行測序，候選單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphisms，SNP)數目為328個，測定每個SNP位點與基於蒽環類藥物的聯合化療總生存期(overall survival，OS)的相關性，鑒定出一個無功能的FPR1等位基因型rs867228，它位於FPR1第2外顯子(1037A>C)。rs867228引起1個氨基酸的替換(Glu346Ala)，抑制FPR1信號，rs867228攜帶者(FPR1CC)與非攜帶者相比(FPR1CA/FPR1AA)，OS和無轉移生存期均縮短。針對結直腸癌的研究也觀察到類似現象。

在攜帶TLR4無功能等位基因型(rs4986790，Asp299Gly)或TLR3無功能等位基因型(rs37755291，Leu412Phe)個體中，rs867228的效應消失，攜帶正常TLR3/TLR4的乳腺癌患者中，rs867228的負面效應才顯效，提示FPR1參與的治療相關通路與這兩個TLR相同。

髓系細胞和某些腫瘤細胞均表達FPR1，研究者構建了不同的實驗模型，MCA205纖維肉瘤不表達FPR1，並不影響米托蒽醌和多柔比星的治療效果，TC-1肺癌也是類似結果，然而若受者小鼠FPR1缺陷，上述化療藥物失效，提示對於基於蒽環類化療藥物而言，FPR1表達在受體小鼠細胞上是必需的，而腫瘤細胞是否表達並不重要。

研究者通過骨髓嵌合實驗進一步研究了FPR1如何影響抗垂死腫瘤細胞的免疫反應，野生型小鼠移植了FPR1缺陷小鼠的骨髓，蒽環類化療葯處理MCA205後接種該小鼠，不能激發有效的抗腫瘤免疫反應，而且該小鼠荷瘤MCA205後，基於蒽環類藥物的聯合化療無效；反之，FPR1－/－的小鼠移植了野生型小鼠的骨髓後，腫瘤對基於蒽環類的聯合化療反應正常，因此宿主免疫系統表達FPR1是化療起效的重要前提。

對FPR1的4個配體進行研究，分別是組織蛋白酶A、序列相似19[趨化因子(C-C基序)樣]家族成員A4、細菌和線粒體中的N-甲醛化肽和膜聯蛋白A1(annexin A1，ANXA1)。通過基因敲除及抗體中和試驗，發現ANXA1是其化療相關的功能配體，兩種蒽環類藥物(米托蒽醌、多柔比星)均能刺激腫瘤細胞分泌ANXA1。基因晶元檢測結果顯示，野生型小鼠與FPR1－/－小鼠接受化療2 d後相比，以下效應的相關基因發生明顯改變：①1型IFN反應；②DC成熟、抗原處理及呈遞；③細胞毒T細胞效應功能。FPR1表達於瘤內CD45＋的白細胞(CD45－細胞不表達)，尤其是Ly6ChighLy6G－，體外實驗顯示，FPR1的表達升高於骨髓來源DC與垂死腫瘤細胞接觸時，與活腫瘤細胞接觸則沒有此現象，提示Ly6ChighLy6G－髓系細胞表達FPR1是非常重要的，它們包括DC及其前體細胞。腫瘤細胞缺失ANXA1或宿主細胞缺失FPR1不影響化療葯導致的腫瘤細胞自噬、凋亡和壞死。宿主FPR1缺失也不影響化療後腫瘤中CD11c＋CD86＋DC、巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤。研究者在體外用微流道裝置證明，FPR1缺陷會導致DC向垂死的腫瘤細胞遷徙。小鼠脾細胞或人的外周血單核細胞(FPR1CC)可表達正常功能的FPR1，用蒽環類化療葯處理野生型腫瘤細胞，它們會向垂死或死亡的腫瘤細胞遷徙，活的腫瘤細胞則無此現象，並且細胞間有超過60 min的接觸，反之，FPR1缺陷細胞(來自於FPR1－/－小鼠，人的細胞型別為FPR1CA或FPR1AA)，不存在如此長時間的相互作用，而且DC和垂死或死亡的Anxa－/－腫瘤細胞之間也不能形成穩定的接觸。FPR1和ANXA1對於化療引起的抗腫瘤免疫反應具有重要作用，並不影響炎症DC(CD11C＋CD86＋Ly6Chigh)被招募到腫瘤局部，但它關係到DC靠近垂死的腫瘤細胞，建立穩定的接觸，攝取腫瘤相關抗原，並呈遞給T細胞。由此可見，FPR1在化療誘導的抗腫瘤免疫中起著重要作用[10]。

3.6　作用機制小結

化療藥物作用於腫瘤細胞，導致其凋亡，分為3個時間段。凋亡前階段：內質網應激導致CRT暴露，CRT與CD91結合，刺激DC吞噬腫瘤抗原；凋亡起泡階段：化療葯通過腫瘤細胞表面的TLR3引起腫瘤細胞發生自噬，垂死的腫瘤細胞釋放ATP，ATP與P2rx7結合，招募DC進入腫瘤灶；凋亡後壞死階段：細胞崩解，HMGB1釋放，與TLR4結合，激活信號通路(MyD88)，DC通過其表面的FPR1與腫瘤細胞表面的ANXA1形成細胞間的穩定結合，誘導DC成熟，DC進行抗原攝取，並呈遞給T細胞。

DC與T細胞的作用包括兩個方面：DC直接作用於CTL；DC通過分泌IL-1β，作用於γδT細胞，分泌IL-17，再作用於CTL。CTL分泌IFN-γ，導致治療抵抗的腫瘤細胞發生ICD。此外，在此過程中還有Ⅰ型IFN的產生，Ⅰ型IFN可以通過自分泌和旁分泌的方式作用於腫瘤細胞的IFNAR(IFN-α受體和IFN-β受體)，使其分泌CXCL10。

3.7　ICD與T細胞產生的IFN-γ

關於IFN-γ的抗腫瘤效應，有研究發現，T細胞分泌的IFN-γ作用於腫瘤相關成纖維細胞(CAF)，導致CAF分泌的血管內皮細胞生長因子(VEGF)減少，通過DLL4和Notch信號通路導致腫瘤局部的血管新生受阻，腫瘤供血發生障礙而導致腫瘤消退[11]。

3.8　ICD對臨床的參考

化療葯誘導ICD將產生特異性T細胞抗腫瘤免疫反應，對於解除腫瘤化療抵抗及清除殘存腫瘤細胞具有重要作用[12,13]。不是所有的細胞毒化療藥物都會誘導機體對腫瘤細胞的免疫性殺傷，例如依託泊苷和絲裂黴素C就沒有這種效應，目前篩選到的具有ICD效應的是3種蒽環類化合物和1種鉑類藥物(奧沙利鉑)。化療葯誘導腫瘤細胞分泌Ⅰ型IFN，類似於病毒感染的狀態，這種良好的反應性可作為化療有效的指標之一。與之有關聯的一個現象是溶瘤病毒也是通過ICD發揮抗腫瘤效應[14,15]，溶瘤病毒在引起細胞崩解的過程中，誘發了特異性的抗腫瘤T細胞免疫[16,17]。提高腫瘤局部ATP濃度，可能有助於招募免疫細胞，提高化療葯的治療效果。FPR1的SNP位點rs867228可作為乳腺癌、結直腸癌化療預後不良的一個預測指標。在1 040種美國食品和藥物管理局(FDA)批准的藥物中，強心苷輔助ICD的效應最強[18]，以往臨床上已有報道，只是當時機制不明，隨著ICD效應的逐步揭示，強心苷可以作為臨床化療葯輔助用藥的參考。

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