「最小版」Cas9！Science報道：新研究有望解決傳統CRISPR「太大」問題

The Cas9 enzyme, key to the CRISPR system, has a lot of fat that it can lose and still serve as a powerful tool. MELETIOS VERRAS/SHUTTERSTOCK.COM

傳統的CRISPR組件包括基礎版釀膿鏈球菌Cas9酶（SpCas9）、引導RNA（gRNA）。其中，SpCas9 會在gRNA的指引下與特定DNA結合，並對其剪切。在臨床應用中，許多研究團隊會構建「醫療包」——將Cas9基因和其他關鍵組件包裹進一個無害的病毒中，從而進入體內細胞實現遺傳缺陷的精準修復。

然而，考慮到SpCas9蛋白由1,368個氨基酸組成，體積太大不能通過病毒包裝和遞送。對此，科學家們希望設計出更精簡版的Cas9。

來自伯克利加州大學的結構生物學家David Savage帶領的研究團隊利用了一個「定向進化」的計劃設計了一個更「苗條」版的Cas9s，並於上周在冷泉港CRISPR年會上分享了最新的研究成果。

改造細則

他們將改造這一蛋白的方法稱為：通過迭代凝膠排阻方法最小化（Minimization by Iterative Size-Exclusion Recombination，MISER）。

首先，這項技術使用兩種酶系統化剪切SpCas9的基因序列，提取出其中編碼不同蛋白結構域的部分序列。

隨後，David Savage和團隊檢測這些分割開的基因序列，以驗證它們是否仍然保留著Cas9結合DNA的能力。他們將有能力的片段組合起來，並添加了特異的truncated options。

迄今為止，他們已經獲得了50萬種變體。「讓我們意外的是，『縮減』後的Cas9可以忍受巨大的基因缺失，工作良好且靈活。」 David Savage解釋道。

早前韓國科學家曾在空腸彎曲桿菌中發現了小型的Cas9酶CjCas9，由984個氨基酸組成。現在，這一最新改造再次「升級」，獲得的最小化的MISER Cas9突變體僅僅只包含880個氨基酸，約為原始SpCas9大小的三分之二。

突破和挑戰

MISER突變不一定可以實現傳統CRISPR-Cas9系統所能完成的一切潛能。其中一個障礙是：一些突變的Cas9s可以鎖定基因組中的特定靶點，但是並不能切斷DNA。

但是，這個功能缺陷的Cas9s同樣也是一個方便的工具，可以運送其他分子到達特定的目的地。一個特彆強大的CRISPR技術——「鹼基編輯」（base editing）則是利用該工具將一種關鍵酶運送至特定鹼基，隨後實現單鹼基的置換。

哈佛大學的化學家David Liu是全球率先研發出單鹼基編輯技術的科學家，他認為此次David Savage團隊的研究是「新方法的一個早期應用，能夠促進基因編輯領域更接近於一個長期目標」。

The genome editor CRISPR cuts DNA with help from a guide RNA (green and red) and a Cas9 enzyme (outline) that latches onto a three-base sequence (yellow). KC ROEYER/UNIVERSITY OF CALIFORNIA, BERKELEY

其他「升級」版Cas9

CRISPR的「光環」很強大，從基因工具到臨床治療，這一技術有著巨大的潛能。然而，脫靶效應一直是該技術應用的瓶頸之一。如何降低脫靶效應？科學家們想出很多妙招。

2015年末，張鋒團隊通過改變構成化膿性鏈球菌Cas9酶的約1，400個氨基酸中的3個氨基酸，研發出「增強型」釀膿鏈球菌Cas9（eSpCas9），將「脫靶編輯」顯著減少至無法檢測到的水平。

2016年初，麻省總醫院的研究團隊猜測，降低Cas9酶與靶DNA之間的互相作用或許可以更加完全地消除脫靶效應。為了驗證推測，他們通過替換DNA鏈重組Cas9酶變體，最終獲得SpCas9-HF1，證實其可以顯著降低脫靶效應。

2017年，CRISPR「女神」Jennifer A. Doudna團隊利用單分子FRET（(F?rster resonance energy transfer）技術發現，Cas9與sgRNA形成的複合物中的REC3結構域負責感知靶向結合（target binding）的準確性，然後向REC2結構域發出信號，讓其為HNH核酸酶域打開一條通路，最終激活Cas9的「剪刀作用」。通過改變REC3部分，研究團隊設計出了一種改良版的、超精確的（hyper-accurate）Cas9——HypaCas9，有望克服脫靶效應。

2018年，David R. Liu團隊帶來了「升級版」的Cas9 變體——xCas9， 證實其在基因編輯時更靈活、更精確，可以靶向更多的基因位點，並減少「錯誤編輯」的風險。他們發現，相比於Cas9，xCas9錯誤編輯的概率降低了。

此外，科學家們還找到了靶向RNA的基因編輯酶C2c2（Cas13a）、CasRx（Cas13d）以及有任意切割單鏈DNA潛能的Cas12a（Cpf1）……未來，我們期待更多的基因編輯酶，給予更多的用途和潛能。

責編：風鈴

參考資料：

本網站所有註明「來源：生物探索」的文字、圖片和音視頻資料，版權均屬於生物探索所有，其他平台轉載需得到授權。本網所有轉載文章系出於傳遞更多信息之目的，且明確註明來源和作者，不希望被轉載的媒體或個人可與我們聯繫(editor@biodiscover.com)，我們將立即進行刪除處理。所有文章僅代表作者觀點，不代表本站立場。

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！