Nature最新成果！規避CRISPR的「脫靶效應」，關鍵在引導RNA

生物探索

編者按

作為最受關注的基因編輯神器，CRISPR技術的臨床價值一直有待落實。但是，這一顛覆性技術的「脫靶效應」一直是阻礙其應用的關鍵障礙之一。近日，科學家們找到了一種預測CRISPR準確性的方法，能夠有效限制其錯誤編輯。

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CRISPR-Cas9基因編輯技術的有效運行依賴於Cas9酶在特定目標位點切割DNA。但是，這一技術卻面臨著「脫靶」的風險，即Cas9酶可能會在錯誤的位置剪切。我們都知道，編輯了「預想之外」的基因，很有可能會帶來不可預控的嚴重後果。

通常，我們檢測非靶標突變（off-target mutations）的方法是：先利用計算機演算法預測出最可能被「錯誤擊中」的區域，然後再檢查這些「危險區域」的缺失和插入情況。

9月12日，《Nature》期刊最新發表一篇題為「In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations」的研究，揭示了一種預測基因組編輯中「錯誤突變」的新策略，並在小鼠試驗中證實精心設計的引導RNA鏈不會產生任何可檢測到的錯誤突變。

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「脫靶效應」有多嚴重

非靶向剪切可能發生在對生物功能沒有影響的基因組位置，也可能會破壞細胞的基本功能。通常，研究人員會利用計算機程序進行預測，但是這些預測依賴於引導RNA如何與DNA結合以及Cas9如何切割的假設。

2017年5月，《Nature Methods》期刊曾發表一篇文章，揭示CRISPR能夠引入數百種意想不到的突變。他們發現，CRISPR確實能夠成功糾正引發失明的基因，但兩隻接受了基因治療的小鼠的基因組中存在超過1500個單核苷酸突變以及超過100處更大片段的缺失和插入。需要強調的是，這些DNA突變都沒有被計算機演算法預測出來。

雖然錯誤概率遠超我們的認知，但是我們依然缺乏一種能夠準確預測CRISPR非靶標編輯的方法，這意味著，目前我們還不清楚這些預測突變是否會發生以及發生的頻率如何。

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最新研究：引導RNA 是關鍵

文章作者、瑞典阿斯利康公司的生物學家Marcello Maresca表示，公司的一個長期目標是能夠使用基因編輯技術治療一些人類疾病。「然而，要想實現CRISPR藥物的潛力，就需要開發出一種方法，能夠讓目標基因得到有效修飾，且基因組其他位置不受影響。」

在這項新研究中，Maresca團隊與哈佛大學和麻省總醫院的生物學家、病理學家J. Keith Joung課題組合作，開發了一種「體內非靶點驗證」的方法（verification of in vivo off-targets，VIVO），可以穩定地鑒定出CRISPR在體內全基因組中的脫靶效應。

首先，他們以小鼠基因組為研究對象，在體外將其DNA剪切成片段，每個片段約包含300個鹼基對，然後連接一系列使DNA形成閉環的「介面」（adapters）。隨後，他們引入一個Cas9核酸酶和引導RNA複合體，它們會在環狀DNA的一些位點上進行切割，使其線性化。最後，研究人員會添加另一批核酸酶，負責降解剩餘未被剪切的閉環DNA。

通過這一系列步驟，研究人員可以對線性化的DNA進行測序，以檢測Cas9在哪些位置進行了切割（無論是有意的還是無意的），同時預測引導RNA是否會在體內引發脫靶效應。

以上體外驗證工作是J. Keith Joung團隊於2017年完成的工作（發表在《Nature Methods》期刊）。現在，他們將成果轉移至體內：利用一引導RNA（在體外預測中，發現其會在基因組中造成數千個錯誤剪切位點）進行小鼠體內試驗。結果顯示，超40%的預測位點在小鼠肝臟中確實發生了突變。

而且，在體外預測中，一個位點出現的頻率越高，它在體內發生突變的可能性就越大。換句話說，引導RNA在體外是「粗心」的，在體內肯定也是粗心的。

研究團隊還檢測了小鼠體內試驗中基因組上的特殊位點——這些點在計算機預測中都屬於可能的脫靶位點，但是在體外試驗中並沒有出現——結果發現，在體內試驗中這些位點並沒有出現突變。這意味著，體外試驗並沒有錯過真正的非目標剪切。

更重要的是，他們證實，設計對靶點高度特異性的引導RNA，可以有效指導小鼠肝臟細胞的基因編輯，且不會出現可檢測到的非靶向突變。

這項研究證實「你最好確保有一個真正準確的引導RNA」，多倫多大學的發育生物學家Janet Rossant表示，「這項研究的突破性在於，VIVO能夠檢測出細胞特定的非靶標突變，而不是依賴於參考基因組序列（不一定能夠反映你所研究的有機體的遺傳背景，或者在臨床應用中患者的遺傳背景）。由於可以針對來自於患者或者特定有機體的基因組DNA在體外進行篩選，因此測序步驟的讀取結果反映了受試者基因組中可能的Cas9目標。」

責編：悠然

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參考資料：1）New Technique Limits CRISPR-Cas9 Off-Target Mutations

2）潑冷水！Nature子刊「大發現」：CRISPR可引發數百種「意外突變」！

3）In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations

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