大家好，本周為大家推薦一篇來自molecular cell上的文章，通訊作者是來自瑞士聯邦理工學院的David Suter教授，他們課題組主要利用單細胞熒光檢測的技術來研究生命過程。
細胞分裂是細胞生命過程中一個重要的步驟，為了保證分裂過程的穩定性，細胞必須保證在進行該過程前自身的蛋白質組被擴增兩倍，並準確的轉移到子細胞中去。在這一過程中蛋白生成和降解的動力學是極其複雜的。之前的研究往往會利用RNA的水平來評估蛋白的翻譯，而對於蛋白的降解只能通過一些特殊的通路，對於特殊的蛋白進行研究。但是近幾年來，單細胞檢測技術為這一問題的解決帶來的福音。單細胞檢測技術被廣泛應用於檢測細胞間的差異，本篇文章就是基於這種檢測手段開發了一種利用串聯熒光探針對細胞分裂過程中蛋白的合成和降解情況進行分析的方法。
之前的一篇文章中將mcherry和快速摺疊的GFP（sfGFP）融合作為探針研究酵母中的蛋白，但是這類蛋白相較於哺乳動物中的蛋白壽命較低，因此為了將這一體系應用在哺乳動物的細胞內，文章選取了具有更長的成熟時間的mOrange2與sfGFP融合，並將這一體系命名為MCFT。利用蛋白生成和降解過程對這兩種熒光蛋白的不同影響來反應結果，由於這四個過程都相對獨立，文章將這四個變數轉變為了四個等式，並利用這些關係來表徵蛋白的活動。文章中首先在小鼠成纖維細胞中優化他們的體系。通過與SNAP-tag的結合，文章設計出了擁有雙重評價體系的單細胞檢測系統。
建立了這一系統之後，他們在小鼠成纖維細胞的蛋白質組中選取了40種內源的蛋白，將設計的體系連接在選擇的蛋白上，並確認了熒光信號和蛋白的定位是基本吻合的。之後他們就誘導包含了40中連接著檢測體系的細胞進行分裂。在這一過程中進行了一次完整的分裂過程後蛋白的熒光信號並沒有穩定，說明這些蛋白的壽命可能要超過細胞自身的分裂流程。因此他們選擇了分列前，分裂過程和分離後3h這一很長的過程作為研究的體系，並且他們將檢測到的熒光信號通過計算機轉變為可視的曲線。他們發現細胞核內的蛋白確實在細胞分裂的過程中增加了一倍，並且這一增加是由於基因翻譯的增多而蛋白降解沒有明顯變化。
在這之後他們關注了在分裂前後1h內的蛋白變化，他們發現在這樣一個時間窗內，蛋白變化是極其豐富的，有的蛋白比較穩定，有的蛋白數量增加而個別蛋白數量甚至出現了減少。他們發現數量減少和數量不變的蛋白主要是由於蛋白合成的速率降低了，而數量增加的蛋白則不是因為翻譯的上調而是因為蛋白降解的減少。這之後他們又另外的SNAP-tag對他們的而結果進行了驗證，發現基本一致。
在這之後，為了發揮單細胞檢測技術的優勢，文章內比較了兩個不同細胞系在分裂過程中蛋白的變化，他們選擇了12個之前研究的蛋白，並在兩個細胞系ESC和NIH 3T3中構建了檢測體系。他們還額外加入halo-tag對檢測結果進行再評估。最後他們發現了兩個細胞中蛋白的半衰期並不一致，說明蛋白的調控在細胞間存在差異。並且在一個細胞中特定蛋白的合成和降解速率的變化是有一定關係的。
總而言之，本文開發了一種可以用於哺乳動物單細胞檢測的熒光探針，可以檢測蛋白生成和講解的過程。利用這一方法，他們發現了細胞分裂期間不同時期蛋白穩態的調控機制，並比較了不同細胞內蛋白穩態的不同。
文章引用：Alber et al., 2018, Molecular Cell 71, 1–13，September 20, 2018
DOI： 10.1016/j.molcel.2018.07.023
文章地址：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(18)30592-6
喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！
本站內容充實豐富，博大精深，小編精選每日熱門資訊，隨時更新，點擊「搶先收到最新資訊」瀏覽吧！
請您繼續閱讀更多來自 王初課題組 的精彩文章:
※新型的RNA成像方法檢測細胞中的RNA
※NifB蛋白中Fe4S4結構與功能的探索
TAG:王初課題組 |
