幹細胞基因編輯領域最新研究進展

背景介紹

從1957年世界上第一例骨髓移植技術成功救治一位重症聯合免疫缺陷患者到現在，幹細胞技術的發展已經長達半個世紀之久。

在這幾十年的研究中，科學家們一次次地見證了奇蹟的誕生，幹細胞治療也逐步由實驗室研究走向臨床試驗，大家期待的「幹細胞治療新時代」即將到來。

據不完全統計，如今幹細胞已經能夠治療以及正處於臨床試驗階段的疾病達到140種。全世界已經保存了200多萬份幹細胞，並進行了數萬例幹細胞移植術，國際上已有10幾個幹細胞產品上市。

隨著近年年來科學家們研究的不斷深入，他們開始使用幹細胞療法治療多種人類疾病，比如癌症、糖尿病、神經變性疾病、脊髓損傷以及多發性硬化症等。如今越來越多的臨床案例表明，幹細胞技術對人類醫療發展有著劃時代的意義，世界各國紛紛將幹細胞列為在人類健康領域提高國際競爭力的戰略性新興產業。

在幹細胞療法飛速發展時，又有一種新型技術因能表現出強大的治療潛力而進入大家的視野，那就是基因編輯技術，基因編輯技術是一種能對目標基因進行「編輯」，實現對特定DNA片段的敲除、摻入的一種技術；未來科學家們對人體基因進行有效編輯有望治療一系列人類疾病。

此前科學家們僅能通過物理、化學誘變和同源重組等方式對目標DNA進行編輯，然而這些方法靶向位點較為隨機，且耗時耗力。

在過去幾年裡研究人員開發出了鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）和轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）兩種技術，這兩種特殊的序列特異性核酸酶技術能夠實現高效定點的基因組編輯功能， 其在基因治療等領域展示出了巨大的潛力，曾經一度成為科學家們所使用的主流基因編輯技術。

然而隨著ZFN和TALEN技術的廣泛應用，其所帶來的問題不斷出現，主要表現為操作繁瑣、周期較長、脫靶率較高等缺陷，這無疑嚴重製約著基因編輯技術在人類疾病治療領域的發展。

2012年，CRISPR/Cas9基因編輯技術問世，立刻掀起了全球科學家的研究高潮，該技術被認為是繼ZFN和TALEN之後的第三代基因編輯技術。

CRISPR/Cas9系統包括兩個元件，分別是Cas9內切酶和guide RNA(gRNA)，gRNA引導Cas9蛋白在靶位點進行切割，形成 DNA雙鏈斷裂(DSB)，該技術能夠幫助研究人員快速而精確地對核苷酸序列進行編輯，不僅操作較為簡單方便，而且成本也較低。

未來CRISPR/Cas9技術的另一個誘人的應用就是通過對機體體細胞基因組進行編輯，來治療多種人類遺傳性疾病，而通過糾正誘發疾病的突變就有可能逆轉患者疾病的癥狀。

幹細胞基因編輯成果概覽

近年來，科學家們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在治療多種疾病上取得了重要的研究進展。

2018年2月，刊登在國際雜誌Science Advances上的一篇研究報告中，科學家們通過研究利用CRISPR/Cas9技術對杜氏肌營養不良（DMD）症患者機體的多能幹細胞進行改造產生了健康的心肌，有望治療杜氏肌營養不良症患者[1]。

同一個月，刊登在Cell雜誌上的兩篇研究報告中，來自懷特黑德生物醫學研究所的研究人員利用一種基於CRISPR/Cas9的技術成功治療了脆性X染色體綜合征[2]。

2018年4月，一項刊登在國際雜誌Nature Genetics上的研究報告中，來自斯坦福大學的科學家們將CRISPR基因編輯技術同DNA條形碼技術結合有效地對癌症的進展進行了追蹤，這種組合性的方法對於未來研究人員進行癌症藥物檢測非常重要[3]。

隨著研究的深入，對幹細胞進行基因編輯的安全性問題也引起了很多人的擔憂，比如就有人會擔心基因編輯會降低幹細胞的穩定性，促進其發生突變，隨著科學家們多項研究成果的刊登，漸漸地打消了人們的顧慮。

那麼近些年來，科學家們在幹細胞基因編輯領域到底取得了哪些重要成果呢？

此前，來自英國桑格研究所和劍橋大學的研究人員首次結合基因編輯技術對患者機體自身誘導幹細胞（induced stem cell）的基因突變進行編輯，修正了一種代謝性肝病患者細胞中的基因突變，這一研究進展開或能幫助重新調整患者自身的細胞，從而成功治療遺傳病[4]。

2017年1月，一項刊登在Science Translational Medicine雜誌上的研究報告中，來自美國國家過敏症和傳染病研究所等機構的研究人員研究人員利用基因編輯工具成功修復了源自X連鎖慢性肉芽腫病患者體內造血幹細胞中的一種缺陷基因。

當移植到小鼠體內後，這些經過修復的造血幹細胞產生功能正常的白細胞，這就提示著這一策略可能潛在能被用來治療X連鎖慢性肉芽腫病患者[6]。

隨後2017年4月27日發表在Stem Cell Reports雜誌上的一篇研究報告中，來自華盛頓大學的研究人員實現了成功利用CRISPR編輯幹細胞來抵抗關節炎的目標。

文章中研究人員利用新型基因編輯技術改造小鼠的幹細胞，使其能夠抵抗關節炎等慢性疾病導致的炎症。

這些經過改造的幹細胞（SMART細胞，幹細胞經修飾用於自主再生療法）能產生製造一種抗炎性生物製劑藥物的軟骨細胞，在理想情況下這些軟骨細胞能夠替換關節炎性軟骨，保護關節和其它組織免受慢性炎症中誘發的損傷[7]。

如今研究人員利用基因編輯技術在生殖幹細胞領域也取得了重要的研究成果，來自中科院上海生命科學研究院的李勁松博士長期從事於體細胞重編程與胚胎髮育相關領域的研究。

2012年，他們建立了只攜帶精子來源遺傳物質的小鼠孤雄單倍體胚胎幹細胞，並證明這一細胞能代替精子在注入卵母細胞後能支持胚胎髮育產生健康的半克隆小鼠（半克隆技術）。

然而單倍體細胞的「受精」能力隨著細胞的傳代逐漸丟失，特別是經過基因編輯後，這些細胞再注入卵子中很難獲得健康半克隆小鼠。

最近，李勁松團隊通過將調控雄性印記基因H19和Gtl2表達的H19-DMR和IG-DMR敲除後獲得了能穩定產生半克隆小鼠的「人造精子」，這一研究突破將不斷推動科學家們在生殖醫學領域的研究進展。

2017年3月，刊登在國際雜誌Oncotarget上的一篇研究報告中，來自中國中南大學的科學家們發表了他們在基因編輯幹細胞抑制腫瘤生長研究領域的新進展。

文章中，研究人員嘗試建立高效穩定表達抗癌因子的病人特異性的人誘導多能幹細胞，從而誘導分化為間充質幹細胞，用於腫瘤的自體化基因治療，這項研究成果首次證明通過非病毒基因打靶病人特異性人誘導多能幹細胞獲得自體間充質幹細胞用於癌症治療的可行性，展示了基因編輯人誘導多能幹細胞在腫瘤自體化基因治療領域的臨床應用前景[8]。

同年7月刊登在國際雜誌Cell Research上的一篇研究報告中，來自中科院生物物理所劉光慧等研究人員成功實現了通過單鹼基基因編輯重塑超級幹細胞的目的。

文章中，研究人員利用基因編輯改寫了人類基因組遺傳密碼中的單個鹼基，首次在實驗室中獲得了遺傳增強的「超級」幹細胞（Genetically Enhanced Stem cells，GES細胞）。這種GES細胞能夠對細胞衰老和致瘤性轉化產生雙重抵抗作用，因此為開展安全有效的幹細胞治療提供了可能的解決途徑。

這一發現對間充質幹細胞的臨床轉化治療具有重要的價值，同時也很好地證實了利用基因編輯技術可以促進幹細胞在再生醫學中的應用，為幹細胞研究提供了值得借鑒的新方法[9]。

2018年3月，來自日本京都大學等處的研究人員通過研究開發了一種新型的基因編輯方法，其能夠以較高的準確度修飾人類基因組中單個DNA鹼基，這種新方法的特殊之處在於其能夠指導細胞自身的修復機制，從而就能為研究疾病相關的突變提供一對基因匹配的細胞。

目前研究人員正在利用胚胎幹細胞進行人類糖尿病臨床試驗，但需要對患者進行慢性的免疫抑制，對患者自身的ips細胞進行基因修正或許能夠幫助產生健康的胰腺細胞，同時還能降低患者移植後出現的排斥反應和概率。

最後研究者Woltjen表示，我們的目標就是能開發出改善對疾病發病機制理解的新型基因編輯技術，最終開發出根治疾病的新型療法，我們相信，MhAX技術在目前多種人類疾病研究中將具有更為廣泛的適用性[10]。

4月份，來自浙江大學的研究人員通過研究建立了對人多能幹細胞進行更高效和精準的基因編輯技術體系—CRISPR-Cpf1技術，研究人員表示，CRISPR-Cpf1基因編輯系統能與小分子藥物進行組合，實現對人多能幹細胞進行更加簡單、高效和精準的基因編輯，從而更好地應用於基礎生物學研究、疾病模型構建、藥物篩選和臨床轉化[11]。

同一個月，發表在PLOS Pathogens雜誌上的一篇研究報告中，來自國外的研究人員通過研究表示，利用基因編輯的幹細胞或許有望消除HIV，文章中，研究者表示，使用基因編輯的骨髓幹細胞可以顯著降低感染猴/人免疫缺陷病毒（SHIV）的豬尾獼猴休眠的「病毒水庫」的大小[12]。

2018年5月刊登在Nature Cell Biology雜誌上的一篇研究報告中，科學家們利用基因編輯技術以及人源胚胎幹細胞技術繪製出了人類基因組的藍圖，揭示了基因對人體健康以及疾病發生的作用。

研究人員通過生成180000種不同的突變，對人類基因組中的所有基因功能進行了分析。其中，他們構建出了一種僅存在一對染色體的新型胚胎幹細胞，並使用了CRISPR-CAS9技術進行大規模突變體的篩選[13]。

此前一項發表在Cell Stem Cell雜誌上的研究報告中，來自美國斯坦福大學等機構的科學家們成功利用CRISPR修飾表觀基因組產生了誘導性多能幹細胞，文章中，研究者發現，一種能夠激活而不是切割DNA的CRISPR形式能夠將胚胎小鼠細胞轉化為誘導性多能幹細胞[14]。

2018年6月，刊登在國際著名雜誌Cell上的一篇研究報告中，來自美國的科學家們利用CRISPR/Cas9技術成功改造造血幹細胞，促進CAR-T細胞療法有效治療急性髓性白血病。

文章中，研究者開發出了一種新方法，能利用CAR-T細胞來治療急性髓性白血病（AML），為了能治療這種白血病，目前研究人員會靶向作用健康細胞中表達的一種名為CD33的特殊蛋白，這種療法並不能在不造成患者其它正常骨髓損傷的情況下來成功攻擊癌症，而本文研究中研究者所開發的新方法則利用基因編輯工具CRISPR/Cas9來移除健康造血幹細胞中的CD33分子，從而攻擊攜帶該分子的癌變細胞[15]。

近年來，科學家們在幹細胞基因編輯領域取得了大量的研究進展，相信未來通過科學家們更為深入的研究必將能開發出更多有效治療多種人類疾病的新型幹細胞基因編輯手段。

近年來，在國家政策的大力支持下，我國幹細胞產業發展迅猛，如今已經形成了全產業鏈模式，預計到2021年，我國幹細胞相關市場規模將接近1500億元。

然而與國外相比，我國幹細胞發展的步伐還需加快，除了聚焦幹細胞及轉化研究的重大基礎科學問題和瓶頸性關鍵技術，我們還要爭取在優勢重點領域取得科學理論和核心技術的原創性突破，推動幹細胞研究成果向臨床應用的轉化，整體提升我國幹細胞及轉化醫學領域技術水平。

為此，生物谷將於2018年11月9日至2018年11月10日在北京舉辦第十屆幹細胞國際研討會，本屆幹細胞國際研討會在秉承此前幹細胞臨床與轉化的會議經驗基礎上，我們圍繞幹細胞重編程與再生醫學、幹細胞臨床研究即幹細胞商業化等多個領域，邀請國內外知名專家學者、業界翹楚、臨床醫生一道進行深入討論，促進合作交流。

同時本次研討會特別設立「青年千人」論壇，為海內外優秀青年學者搭建學術交流平台。

本次幹細胞國際研討會已邀請中科院廣州生物與健康研究院裴端卿教授、仁濟醫院的管陽太主任、浙江大學遺傳學研究所徐鵬飛研究員、喬治城大學劉學鋒教授等知名幹細胞領域研究者，屆時我們將會在幹細胞基因編輯、多能性、幹細胞與多種疾病關聯等領域進行深入交流探討，裴端卿教授主要研究主要研究領域為幹細胞的多能性維持與體細胞重編程，細胞內蛋白與膜運送機制，其代表性學術成果發表在Nature，PNAS，JBC 等國際期刊上，共計50多篇研究論文，引用達2000餘次。

2017年，裴端卿教授和舒曉東教授通過聯合研究，報道了關於調控人胚胎幹細胞向肝系細胞分化的機理，相關研究成果為多能幹細胞分化提供細胞生物學的機理，為解決幹細胞在再生醫學運用中打開一扇新門窗；與此同時，在統一體細胞重編程與幹細胞分化這兩個看似相反過程的機理研究中邁出一大步，促進細胞命運調控理論體系的建立[16]。

2017年10月，裴端卿教授以及來自加州理工學院等處的多位學者在Cell Stem Cell雜誌上刊登了一篇題為「Human Embryo Editing: Opportunities and Importance of Transnational Cooperation」的研究報告，論述了科學界通過組織人類基因編輯委員會和國際學術峰會為人類基因編輯，尤其是可遺傳的胚胎基因編輯提供詳細的指導意見的努力，並著重描述了人類胚胎基因編輯對於胚胎髮育等基礎研究的重要推動作用，以及國際學術合作對人類胚胎基因編輯的潛在臨床應用的重要意義[17]。

2018年4月，裴端卿教授在Cell Stem Cell發表最新研究研究成果，文章中研究者表示，他們開發了簡單、高效、標準化製備幹細胞的方法，即一種名為化合物誘導幹細胞多能性的技術（CIP，Chemical Induction of Pluripotency），該技術能為誘導多能幹細胞的研究和優化製備途徑提供了全新的科學視角和解決方案[18]。

其他已邀請的嘉賓也在幹細胞研究領域取得了多項成果和項目，比如2018年5月，由仁濟醫院神經內科科主任管陽太牽頭的幹細胞多中心臨床研究項目《臍帶源間充質幹細胞治療視神經脊髓炎譜系疾病的前瞻性多中心隨機對照研究》按照《幹細胞臨床研究管理辦法（試行）》的規定完成了國家衛健委備案。仁濟醫院神經內科牽頭開展的臨床研究是首個將人臍帶源間充質幹細胞（hUC-MSC ）治療視神經脊髓炎譜系疾病（NMOSD）的大型多中心臨床試驗，探討人臍帶源間充質幹細胞治療NMOSD的安全性和有效性，為該新療法在臨床治療應用提供循證醫學證據。

2018年11月9-10日，我們將相聚北京召開第十屆幹細胞國際研討會，會議上我們將圍繞幹細胞重編程、幹細胞臨床研究、幹細胞規模化製備，監管等多個領域，與國內外知名專家學者、業界翹楚、臨床醫生一同深入討論，促進合作交流，快來參會吧！

重要會議推薦： 2018（第十屆）幹細胞國際研討會

會議亮點

1.探討幹細胞基礎研究的熱點與難點

圍繞幹細胞重編程、幹細胞乾性維持與定向分化，幹細胞與組織器官修復、類器官等進行深入交流

2.推動幹細胞治療的臨床轉化

圍繞幹細胞臨床轉化過程中遇到的問題， 邀請專家、臨床醫生等解答

3.促進幹細胞治療的完善與發展

討論幹細胞治療規範和標準， 幹細胞的存儲、製備的自動化

會議時間：2018年11月9日-10日

會議地點：北京元辰鑫國際酒店

參考資料：

【1】Chengzu Long， Hui Li， Malte Tiburcy， et al. Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing. Science Advances 31 Jan 2018：Vol. 4，no. 1，eaap9004 DOI：10.1126/sciadv.aap9004

http：//advances.sciencemag.org/content/4/1/eaap9004

【2】X. Shawn Liu， Hao Wu， Marine Krzisch et al. Rescue of Fragile X Syndrome Neurons by DNA Methylation Editing of the FMR1 Gene. Cell，Published online： February 15， 2018， doi：10.1016/j.cell.2018.01.012

https：//doi.org/10.1016/j.cell.2018.01.012

X. Shawn Liu， Hao Wu， Xiong Ji et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell， 22 September 2016， 167(1)：233-247， doi：10.1016/j.cell.2016.08.056

https：//doi.org/10.1016/j.cell.2016.08.056

【3】Zoe N. Rogers， Christopher D. McFarland， Ian P. Winters， et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics (2018) doi：10.1038/s41588-018-0083-2

【4】Yusa K，Rashid ST，Strick-Marchand H， et al. Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 2011 Oct 12；478(7369)：391-4. doi： 10.1038/nature10424

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21993621

【5】Yuichiro Miyaoka，Jennifer R. Berman，Samantha B. Cooper， et al. Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effects of locus， nuclease， and cell type on genome-editing. Sci Rep. 2016；6：23549.doi：10.1038/srep23549.

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4814844/

【6】Suk See De Ravin， Linhong Li， Xiaolin Wu， et al. CRISPR-Cas9 gene repair of hematopoietic stem cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Science Translational Medicine 11Jan 2017，Vol. 9，Issue 372，eaah3480

DOI：10.1126/scitranslmed.aah3480

http：//stm.sciencemag.org/content/9/372/eaah3480

【7】Jonathan M. Brunger， Ananya Zutshi， Vincent P. Willard et al. Genome Engineering of Stem Cells for Autonomously Regulated， Closed-Loop Delivery of Biologic Drugs. Stem Cell Reports，Published Online： 27 April 2017， doi：10.1016/j.stemcr.2017.03.022

https：//linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S2213671117301285

【8】Bo Liu，Fei Chen，Yong Wu， et al.Enhanced tumor growth inhibition by mesenchymal stem cells derived from iPSCs with targeted integration of interleukin24 into rDNA loci. Oncotarget. 2017； 8：40791-40803. doi：10.18632/oncotarget.16584.

【9】Jiping Yang，Jingyi Li，Keiichiro Suzuki， et al. Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by a single nucleotide recoding. Cell Research volume 27，pages 1178–1181 (2017) doi：10.1038/cr.2017.86.

https：//www.nature.com/articles/cr201786

【10】Shin-Il Kim， Tomoko Matsumoto， Harunobu Kagawa， et al. Microhomology-assisted scarless genome editing in human ipsCs. Nature Communications (2018)

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29610531

【12】Peterson CW， Wang J， Deleage C， Reddy S， Kaur J， Polacino P， et al. (2018) Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs： Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathog 14(4)：e1006956. doi.org/10.1371/journal.ppat.1006956

http：//journals.plos.org/plospathogens/article？id=10.1371/journal.ppat.1006956

【14】Peng Liu， Meng Chen， Yanxia Liu et al. CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency. Cell Stem Cell， Available online 18 January 2018， doi：10.1016/j.stem.2017.12.001

https：//linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1934590917305015

【15】Miriam Y. Kim， Kyung-Rok Yu， Saad S. Kenderian， et al. Genetic Inactivation of CD33 in Hematopoietic Stem Cells to Enable CAR T Cell Immunotherapy for Acute Myeloid Leukemia. Cell (2018) doi：10.1016/j.cell.2018.05.013

https：//www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)30590-7

【16】Qiuhong Li， Andrew P. Hutchins， et al. A sequential EMT-MET mechanism drives the differentiation of human embryonic stem cells towards hepatocytes. Nature Communications volume 8， Article number：15166 (2017) doi：10.1038/ncomms15166.

https：//www.nature.com/articles/ncomms15166

【17】Duanqing Pei，David W. Beier，Ephrat Levy-Lahad， et al. Human Embryo Editing： Opportunities and Importance of Transnational Cooperation. Cell Stem Cell， OCTOBER 05， 2017， doi：10.1016/j.stem.2017.09.010.

https：//www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(17)30377-6？code=cell-site

【18】 Shangtao Cao，Shengyong Yu，Dongwei Li，et al. Chromatin Accessibility Dynamics during Chemical Induction of Pluripotency. Cell Stem Cell，APRIL 05， 2018. doi：10.1016/j.stem.2018.03.005

https：//www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(18)30111-5？code=cell-site

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