研究發現RNA剪接基因編輯的新方法

近日，國際學術期刊《分子細胞》在線發表了中國科學院上海生命科學研究院（營養與健康研究院）常興研究組題為Genetic modulation of RNA splicing with a CRISPR-guided cytidine deaminase的最新研究成果。證明可以利用TAM (Targeted-AID induced mutagenesis)基因編輯，靶向DNA上的RNA剪接順式元件，高效調控RNA剪接，用於研究RNA可變剪接的功能，以及用於人類遺傳疾病的治療。

真核細胞中，RNA剪接是基因表達的重要環節。據估計，超過75％的人類基因具有一種以上的mRNA剪接方式（可變剪接），其中大部分可以翻譯為功能性蛋白質。但相對於基因功能而言，對於可變剪接的生理功能，認識還非常有限，原因主要在於調控內源RNA剪接的實驗手段非常有限。RNA剪接的異常也是許多疾病的直接誘因，估計35~50％的人類疾病由基因剪接異常造成。因此，無論是從學術研究或是臨床應用的角度，都亟需開發出調控RNA剪接的基因編輯新方法。

常興研究組過去開發TAM (Targeted AID-induced mutagenesis)，也就是融合核酸酶活性缺陷的Cas9蛋白和胞嘧啶脫氨酶AID，並且發現它具有兩個特點。首先，可以在sgRNA靶向的DNA上，將C/G鹼基隨機向其它鹼基突變，可以用於分析腫瘤耐藥性突變及誘導蛋白體外進化等；其次，在偶聯UNG抑製劑UGI後，可以在將sgRNA靶向區域中一個小窗口內（5-6個鹼基）的C高效向T突變 (Nature Methods, 2016)。

在這一新研究中，博士研究生袁娟娟和馬雲青首先注意到，98%以上的內含子有保守的GU（內含子開始）和AG（內含子末尾）序列，推測如果可以高效精確地將G突變成A，可以特異性阻斷外顯子識別，調控內源性mRNA的剪切。通過這一策略，利用TAM誘導剪接位點DNA上G>A突變，就可以誘導可變外顯子(alternative exon)及組成性外顯子(constitutive exon)的跳讀 (Exon skipping)；改變可變剪接位點的選擇(Alternative splice site)；調節互斥外顯子的選擇(mutually exclusive exons)；誘導小的內含子的包含 (intron retention)。此外，如果通過TAM將３』剪接位點上游polypyrimidine track中包含的C向T突變，可以促進下游外顯子的包含。因此，利用TAM可以成功地實現針對RNA剪接的「loss of function」和」gain of function」調控。

最後，研究人員探索了利用TAM修復杜氏肌營養不良症（DMD）的可行性。DMD是一種致命的遺傳疾病（發病率男性中1/4000）。其發病原因在於，遺傳突變造成Dystrophin蛋白的完全缺失，引發肌肉萎縮和癱瘓，最終造成心臟或肺功能的衰竭。如果通過外顯子跳讀，能產生內部截短的Dystrophin蛋白，可以達到對DMD的治療效果。因此研究人員構建了DMD病人來源的誘導型多能幹細胞，此病人因為外顯子刪除造成Dystrophin蛋白的完全缺失。通過在剪接位點誘導G>A的突變，研究人員實現了目標外顯子的完全跳讀，在所有表達TAM的細胞中恢復了Dystrophin的蛋白表達，修復了心肌細胞的缺陷。

該研究得到科技部、國家自然科學基金委、中科院先導計劃和上海市科委相關項目的資助。

TAM 融合蛋白高效調控外顯子跳讀、互斥外顯子選擇、可變剪接位點選擇和內含子包含

來源：中國科學院上海營養與健康研究院

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