復旦大學袁正宏組揭示外泌體傳遞IFN-α誘導的抗病毒效應進入肝細胞的機制

Virologica 導讀

近日，復旦大學袁正宏教授團隊在前期工作的基礎上，揭示了外泌體利用病毒入侵的分子機制傳遞IFN-α誘導的抗病毒效應進入肝細胞的詳細機制。相關成果在線發表在國際病毒學期刊Journal of Virology上。原文題為「Exosomes exploit the virus entry machinery and pathway to transmit IFN-α-induced antiviral activity」。

由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎仍是危害人類健康的重大問題。慢性乙肝有較高的風險進一步發展為肝硬化，甚至肝癌。干擾素-α（Interferon-α, IFN-α）是臨床上乙肝治療的主要手段之一，直接的抗病毒效應和間接的免疫調節是干擾素抗乙肝的重要基礎，其詳細的分子機制一直是國內外學者研究的重點和熱點。本課題組前期的研究發現巨噬細胞在內的肝非實質細胞（nonpermissive liver nonparenchymal cells，LNPCs）可通過外泌體（exosome）傳遞IFN-α誘導的抗病毒效應至HBV複製的肝細胞中，反拮抗病毒對IFN-α抗病毒活性的干擾，從而有效抑制HBV在肝細胞中的複製，但外泌體是依賴何種機制進入肝細胞以傳遞IFN-α誘導的抗HBV效應有待深入闡明。

本研究中，袁正宏團隊首先發現巨噬細胞來源的外泌體可以借鑒病毒入胞的分子機制進入肝細胞，從而傳遞IFN-α誘導的抗HBV效應。巨噬細胞外泌體將凋亡標誌物磷酯醯絲氨酸（Phosphatidylserine，PtdSer）暴露於表面，通過類似病毒「凋亡模擬」的方式，經甲肝病毒受體TIM-1 (T cell immunoglobulin and mucin receptor 1)進入肝細胞。進一步實驗證明TIM-1在外泌體入胞以及傳遞抗病毒活性中也起了關鍵作用，抑制TIM-1在HBV複製細胞系HepG2.2.15中的表達阻礙了外泌體對IFN-α誘導的抗HBV活性的傳遞。

後續實驗證明與病毒入胞密切相關的網格蛋白介導的內吞（CME）及大胞飲也是巨噬細胞外泌體進入肝細胞的主要內吞途徑。使用CME抑製劑氯丙嗪或者敲低肝細胞中網格蛋白重鏈（clathrin heavy chain, CHC）的表達均可有效抑制外泌體進入肝細胞（圖1）。此外，將肝細胞與巨噬細胞外泌體共孵育可以刺激肝細胞的液相內吞（fluid-phase uptake），而液相內吞的增強被視為大胞飲發生的標誌，應用大胞飲經典抑製劑EIPA及大胞飲相關絲氨酸/蘇氨酸激酶抑製劑均能顯著抑制巨噬細胞外泌體進入肝細胞。然而出乎意料的是， Rac1及Cdc42突變並不影響肝細胞對巨噬細胞外泌體的攝取，這說明外泌體有可能是通過Rac1及Cdc42不依賴的非典型大胞飲方式進入肝細胞。同理，抑制CME及大胞飲後可阻礙巨噬細胞外泌體傳遞IFN-α誘導的抗病毒效應至HBV複製的肝細胞。

圖1 外泌體網格蛋白介導的內吞進入細胞。

進一步深入研究發現，內吞入肝細胞的巨噬細胞外泌體會與內體界膜融合以便釋放其內容物，逃逸溶酶體降解，這與病毒內體穿透（endosome penentration）的機制類似。活細胞成像捕捉到了內吞入肝細胞後，膜融合探針R18 (hydrophobic dye rhodamine C18)標記的外泌體所發出的膜融合熒光信號，其與標記的晚期內體（late endosome, LE）標誌蛋白RAB7，及多囊泡體(multivesicular body, MVB)標誌蛋白CD63有共定位（圖2）。同時發現，參與病毒內體穿透的重要脂質LBPA（lysobisphosphatidic acid）在巨噬細胞外泌體的膜融合中也起著重要作用，使用特異性抗體封閉肝細胞內的LBPA可以顯著抑制巨噬細胞外泌體的膜融合從而促進外泌體內容物向溶酶體的轉運。

圖2. 內吞入肝細胞的巨噬細胞外泌體會與內體界膜融合以便釋放其內容物。

這項研究從結合受體、內吞至潛在的內體逃逸，深入揭示了巨噬細胞外泌體傳遞IFN-α抗病毒效應入肝細胞的具體機制，發現外泌體與病毒在入胞機制上的相似點，證明巨噬細胞外泌體可以通過病毒受體（TIM-1）、病毒常用的內吞通路（CME及大胞飲），以及最後依賴病毒內體穿透機制（LBPA依賴的內體膜融合）傳遞IFN-α誘導的抗HBV活性。這項工作也為改造外泌體成運輸抗病毒分子的高效治療性載體提供了理論基礎。

該研究以袁正宏團隊前期發表於Nature Immunology的工作「Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity」為基礎，並得到國家自然科學基金，國家重大科技專項以及國家重點研發計劃的資助。此次發表的研究論文，姚真藍、喬雲聖為共同第一作者，袁正宏、李建華為共同通訊作者。該室陳捷亮、沈芳、白露博士以及博士研究生李曉芳、丁家惠、施碧勝也為該研究作出了重要貢獻。

近日，袁正宏課題組還與復旦大學附屬公共衛生臨床中心科學研究部慢性乙型肝炎研究組、肝炎科、華山醫院傳染病研究所合作在Journal of Virology上刊登了「Extracellular HBV RNAs are heterogeneous in length and circulate as capsid-antibody-complexes in addition to virions in chronic hepatitis B patients」的研究成果。該研究揭開了乙肝病毒RNA分子在患者血清中的神秘面紗。

中國病毒學英文版

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