Science：重磅！發現迄今為止最小的功能性CRISPR系統

一群古老的包含地球上一些最小生命形式的微生物也擁有迄今為止發現的最小的CRISPR基因編輯系統。在這種基因編輯系統中，一種稱為Cas14的蛋白與Cas9存在著親緣關係，但在大小上僅為後者的三分之一。Cas9是革命性基因編輯工具CRISPR-Cas9中的一個發揮作用的蛋白組分。

雖然Cas9是從細菌中分離出來的，但是Cas14是在一群古細菌---細菌的原始親屬---的基因組中發現的。Cas9和其他的Cas蛋白是細菌進化出來的保護自己免受病毒入侵的防禦系統的一部分。作為靶向酶，它們非常有選擇性地尋找和結合細菌中的特定DNA或RNA序列，即那些與CRISPR記憶庫中儲存的序列相匹配的DNA或RNA序列，隨後切割這種DNA或RNA序列，從而阻止新的病毒入侵者。與Cas9一樣，Cas14具有作為生物技術工具的潛力。由於具有較小的體積，Cas14可能用於編輯小細胞或某些病毒中的基因。不過鑒於它的單鏈DNA切割活性，它更有可能改善目前正在開發的用於快速診斷傳染病、基因突變和癌症的CRISPR診斷系統。

美國加州大學伯克利分校研究生Lucas Harrington說，「對分子診斷學而言，你希望能夠靶向雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA。Cas12非常擅長識別雙鏈DNA，Cas13非常擅長識別單鏈RNA，如今Cas14湊成全套了：它非常擅長識別單鏈DNA。」

Cas14與Cas12和Cas13相類似，這是因為在結合到它的靶DNA序列上後，它開始不加選擇地切割細胞內的所有單鏈DNA。相反，Cas9僅結合併切割靶雙鏈DNA。不加選擇地切割單鏈DNA可能是治療中的一種缺點，但在診斷方面具有很大的優勢。Cas14蛋白可與附著在單鏈DNA片段上的熒游標記物組合使用。當Cas14與它的靶DNA序列（一種癌基因或傳染性細菌中的一種基因）結合併開始切割DNA時，它也會切割與這種熒游標記物連接在一起的單鏈DNA片段，從而產生熒光信號。

作為Harrington的一名同事，Janice Chen補充道，「Cas14以比Cas12更特異性的方式靶向單鏈DNA。這真地是一個非常意外的發現。這是因為它太小了，我們幾乎認為它無法發揮作用，但是實際上，它是超級特異性的，這使得它成為診斷工具箱的一個非常強大的補充。」

Harrington、Chen及其同事們（包括CRISPR-Cas9發明人、加州大學伯克利分校分子與細胞生物學教授Jennifer Doudna），已對Cas14進行改進，使得它能夠用於當前使用Cas12和Cas13快速檢測傳染性生物和基因突變存在的診斷系統（稱為DETECTR）之中（Science, Published Online: 15 Feb 2018, doi:10.1126/science.aar6245）。Harrington、Doudna和Chen是一家名為Mammoth Biosciences的公司的聯合創始人，該公司正在將DETECTR商業化。

相關研究結果於2018年10月18日在線發表在Science期刊上，論文標題為「Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes」。Doudna是這篇論文的通信作者。

分析宏基因組（metagenome）

Cas14蛋白是由論文共同第一作者Harrington和現任以色列特拉維夫大學教授David Burstein發現的，這是因為他們在過去15年在由他們的加州大學伯克利分校同事們創建的一種微生物基因組資料庫中尋找Cas蛋白變體。通過對來自各種外來環境的樣品中的所有DNA進行宏基因組測序，他們獲得了成千上萬種基因組。在從科羅拉多州來複鎮（Rifle）的一個有毒的凈化場所獲得的地下水樣品中經過測序的古細菌基因組中發現了Cas14。

兩年前，Harrington和Burstein在分析宏基因組學資料庫時發現了其他的小Cas蛋白：CasX和CasY（Nature, Published online: 22 December 2016, doi:10.1038/nature21059）。Cas14的長度為400至700個氨基酸，為CasX的一半，而且小於所有其他的長度在950～1400個氨基酸的Cas蛋白。

Harrington 說，「我們偶然發現了這些非常小的蛋白質，但是其他人因它們看起來不像之前已知的CRISPR系統，將它們扔掉了。它們太小了。管它的，我們決定讓我們試一試。我們進行了測試，我們非常吃驚地發現這些都是真正的功能性系統。」

在這個資料庫中找到編碼Cas14的基因只是一個開始。迄今為止，大多數Cas蛋白都是在細菌中發現的，這是因為它們在標準的實驗室細菌---大腸桿菌---中很好地發揮作用。但是Cas14來自古細菌，而且是來自一群最小的稱為DPANN的古細菌。所有已知的Cas蛋白都會整合一些RNA用於靶向識別和結合，但是Cas14不能與CRISPR-Cas9 RNA一起使用，因此這些研究人員還必須從這個資料庫中找到讓Cas14發揮功能而必須存在的兩種RNA。

此外，DPANN古細菌不能在實驗室中培養---它們似乎是寄生性的或者說在某種程度上依賴於其他較大的古細菌，因此這些研究人員必須在試管中創造合適的培養環境。

Harrington說，與Cas14在更原始的細菌中的起源相一致的是，它似乎是更大和更複雜的Cas9和Cas12蛋白的一種更原始的版本，這提示著這些分子已經過更長時間的進化而更具特異性。這些研究人員希望了解這些原始的Cas蛋白，這樣他們就能夠設計出最緊湊的最時尚的基因切割器。

Harrington指出，這種宏基因組分析發現了Cas14的多種版本，這些版本可能經證實是有用的生物技術工具。他說，「一個令人驚奇的事情......就是這些系統的多樣性。我們已描述了40多種新的CRISPR-Cas14系統和8種不同的亞型。這就為研究這些新的CRISPR系統打開了大門。」（生物谷 Bioon.com）

參考資料：

Lucas B. Harrington1,*,?, David Burstein2,*,?, Janice S. Chen et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science, Published Online: 18 October 2018, doi:10.1126/science.aav4294.

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！