國際基因編輯科技發展報告

以特異性的改變遺傳物質靶向基因序列為目標的基因編輯技術是近年生命科學領域最熱門的研究領域之一。圍繞基因編輯的相關領域研究和人物事件連續多年入選Nature國際科學事件和科學人物。

基因編輯是順承基因測序、基因組功能研究之後對生命現象從觀察性研究到操縱性研究的進一步深入。基因編輯技術的探索始於上世紀八十年代人類基因組計劃，但真正引發學界高度關注並廣泛應用是源於2010年後更為廉價、高效的CRISPR技術平台出現。近年，基因編輯技術的研究熱度和應用領域得以迅速提升和拓展，相關進展主要表現在如下三方面，一是基因編輯技術本身的發展，持續衍生併產品化開發了更為精準、高效、低成本的基因編輯技術；二是基因編輯技術在幹細胞、免疫細胞、基因篩查等生命科學基礎研究領域的拓展應用，已成為一項重要基礎性工具；三是基因編輯技術在疾病基因治療中探索發展，為遺傳病、腫瘤、眼科疾病等多種重大疾病的治療提供了新的治療路徑。

與人類基因組計劃由多國政府大力組織推進有所不同，作為顛覆性技術的基因編輯當前還面臨較多的技術不確定性和倫理風險，主要國家對於基因編輯的戰略計劃還在監管探索和醞釀實施中。相對於國家較為保守的態度，學界和產業界在基因編輯技術的推進中顯得更為積極。我國在《「十三五」國家科技創新規劃》、《「十三五」生物技術創新專項規劃》、《「十三五」生物產業發展規劃》等一系列規劃中明確布局了基因編輯技術的研發與應用。我國學者在基因編輯應用研究和基於基因編輯技術的疾病基因治療中的探索研究方面位居世界前列，但我國在基因編輯技術本身的研究缺乏原創和突破性成果，也正是由於在基因編輯技術本身研發的薄弱，使得我國基因編輯產業界的發展也相對落後。

總體，基因編輯技術拉開了從遺傳物質層面操縱生物和生命現象的序幕，未來對於國家競爭力、學界和產業界上均會有深刻的影響。

正 文

自上世紀中葉，隨著現代生物技術的發展，科學界對於人類的探索逐漸從組織器官水平、細胞水平，逐漸深入到基因水平。以人類基因組計劃為代表的大科學計劃開啟了人類基因時代的序幕，並逐漸推動科學研究從基因測序（基因讀取）、基因組功能研究向基因操縱（轉基因、基因編輯）的領域縱向發展。不同於傳統轉基因技術具有的外源基因隨機插入等不可控的問題，基因編輯技術可以實現對基因組固有序列進行原位鹼基水平的精確修飾，從而達到解析生命機制，了解疾病發生機制和治療疾病的目的。基因編輯將為基礎研究和轉化醫學帶來革命性的變革，是下一代生物技術的核心，當前在生物醫學、人口健康等領域發揮了重要的作用。

一、基因編輯國際科技戰略布局

1.人類基因組計劃開啟基因時代的序幕

1983年和1984年,美國能源部(DOE)和國立衛生研究院(NIH)分別組織相關領域科學家研討啟動大規模人類基因組測序計劃的可能性，人類基因組計劃（HGP）的進入醞釀階段。1987年HGP智庫發表了《測定和繪製人類基因組圖譜》的報告，宣布HGP進入具體實施階段，標誌著HGP計劃的正式實施啟動。1988年美國國會通過了DOE和NIH關於啟動HGP的申請，兩家主要資助者協議共同支持HGP，開展人類基因組測序研究並推動相關技術的發展。1993年，人類基因組遺傳圖譜製作完成，第一代熒光自動測序儀順利問世，HGP進入真正的規模化數據獲取階段。2003年，HGP最終由美、英、法、德、日、中6國逾千名科學家參與，我國科學家承擔了1%的測序任務。

HGP是測定人體染色體所包含的由20億個鹼基對組成的核苷酸序列，繪製人類基因組圖譜，並且識別其載有的基因及序列，達到破譯人類遺傳信息的最終目的，HGP最終確定了組成人類基因組的基因約為25000個左右。HGP計劃總體耗資高達30億美元，但其創造了巨大和深遠的經濟價值和社會價值。

HGP是由政府主導和支持的，但同時也充分調動和協調了政府、社會、企業的綜合力量。科研成果和技術研發又為企業注人了新的知識產權，也為企業發展提供了明確的方向。十幾年來，HGP為美國社會創造了超過200倍的經濟回報，超過30萬個工作機會；同時也實現了美國在相關高科技領域的持續性主導，比如DNA測序、高端分子檢測、生物信息、生物製藥等領域。

2.功能基因組計劃推動後基因組時代的發展

繼HGP之後，進一步解析基因組功能及其與人體健康與疾病間關係的功能基因組計劃陸續開展，後基因組時代逐漸開啟。後基因組是利用結構基因組所提供的信息和產物，發展和利用新的實驗手段，通過在基因組和系統水平上全面分析基因的功能，使得生物學研究從對單一基因或蛋白質的研究轉向多個基因或蛋白質同時進行系統的研究，是在基因組靜態鹼基序列弄清楚之後轉入對基因組動態的生物學功能研究，研究內容包括基因組發現、基因表達分析及突變檢測。

不同於HGP採用國際聯合體的大科學計劃的實施模式，後基因組時代的一系列相關功能基因組計劃相對小規模和零散布局，主要由學界推動，其影響力遠不如HGP。如2002年的「人類單倍體型圖計劃」（HapMap）將遺傳多位點與特定疾病風險進行關聯的功能基因組研究，由日本、英國、加拿大、中國、奈及利亞和美國科學家合作完成，目標是構建人類基因組中常見遺傳多位點的目錄，用於發現與疾病及個體治療反應相關的多位點。2008年啟動的中、英、美、德4國科學家共同承擔的「國際千人基因組計劃」，總測序任務是1200人，旨在繪製人類基因組遺傳多態性圖譜。2006年美歐聯合啟動「小鼠全基因敲除計劃」主要目的是敲除小鼠基因組中2萬個基因庫中的每個基因，對基因組功能進行研究，基於小鼠基因與人類基因的高度同源性，從而推動人類基因組功能的研究的快速進展。

3.人類基因編輯計劃處於醞釀之中，面臨較大爭議

自本世紀以來，政府、學界機構和企業持續開展大量的基因相關衍生的科研計劃，並且逐漸深入，研究內容已經從最初的測序、功能基因組研究，逐漸深入到基因編寫領域。但由於基因編輯存在大量的技術不可控性和倫理風險問題，作為大規模的國家計劃仍面臨較大的爭議，至今尚未出現國家層面的科技戰略和計劃布局。但由於基因編輯技術本身突飛猛進的發展以及基因編輯的應用需求的急速提升、應用範圍的迅速擴展，基因編輯/編寫計劃在學界已有廣泛的討論，在國家層面的基因編輯計劃尚處於醞釀中，布局和出台或僅僅是時間的問題。

HGP計劃重點是測定人類基因組的核苷酸序列，被稱為人類基因組讀取計劃（HGP-Read），與之對應的基因編寫計劃（HGP-Write）已在學界逐漸醞釀產生。2016年6月Science期刊公布了學界醞釀提出的一項公共-私人計劃：從頭合成完整的人類基因組（Science,），即人類基因組編寫計劃（Human Genome Project-Write, HGP-write）。紐約大學合成生物學家Jef Boeke、哈佛醫學院基因組科學家George Church和商業設計工作室歐特克研究中心未來學者Andrew Hessel是此項計劃的主要倡議者。HGP-write計劃的目的是開發降低DNA合成成本新技術，並致力於解決一系列人類健康的挑戰，潛在的應用包括可移植人類器官、通過基因組重編輯進行抗病毒免疫、腫瘤基因組治療，使用人細胞和器官加速高效疫苗和藥物的生產。2016年擬從公共機構、私人機構、慈善機構和研究院所籌集1億美元用於啟動該計劃。但由於基因合成和編輯技術的不可控性和倫理問題的較大爭議，該計劃還處於爭議的階段，人類基因組編寫計劃仍在進一步爭議中。

2018年1月，美國NIH跨出了重要一步，發布報告稱在未來６年內通過共同基金支持1.9億美元資助基因組編輯研究，以解決基因編輯在疾病治療中的一些技術問題，重點布局改善在患者體內運送基因組編輯工具的機制、開發新型或改進基因組編輯器、開發在動物和人類細胞中測試基因組編輯工具安全性和有效性的方法，以及組裝可供科學界共享的基因組編輯工具包。

4.人類基因編輯的技術和倫理監管面臨較大挑戰

由於基因編輯技術的快速發展及其在生物醫學研究領域的廣泛應用的需求，急需技術和倫理監管的有效跟進，在最大範圍控制所存在的技術和倫理風險的同時，推動技術的快速發展。科學的進步引發了對於人類基因組編輯的擔憂，例如如何平衡潛在利益與意外傷害風險、如何規範基因組編輯的使用、如何尊重個人、國家和文化的不同視角，這些是否影響技術使用。在此方面，國際學界和各國政府都在高度關注和積極調整相關的監管措施。

（1）國際學界積極探索人類基因編輯的技術和倫理監管

2017年5月，JAMA發布美國科學院關於人類基因編輯的技術原則的報告「Toward ResponsibleHuman Genome Editing」（下文簡稱「報告」），從技術倫理的角度對該項新技術在基礎實驗室研究、體細胞的臨床應用、生殖細胞臨床應用方面提出了規範和監管建議。在基礎實驗室研究方面，報告指出基因組編輯的基礎研究應在倫理規範和監管框架下進行的，包括地方和國家監督委員會，以確保實驗室的安全和保護捐贈組織和細胞研究的人的利益。報告認為，涉及體細胞和生殖細胞的基礎研究對於科學和醫學的進步是至關重要的，並建議在現有的監管結構下繼續這項研究。在體細胞的臨床應用方面，報告認為在現有的監管框架下，在治療或預防疾病或殘疾方面，體細胞基因組編輯的臨床試驗應繼續進行。但將基因組編輯用於修改身體性狀和獲得超能力方面的應用不應當被批准。在生殖細胞臨床應用，報告認為對於任何生殖編輯行為應保持謹慎，但謹慎並不意味著禁止。該報告建議，生殖細胞編輯的臨床試驗可以允許，但只有經過更多的研究，以滿足適當的風險/利益標準時才能授權這些試驗。報告認為下列的遺傳性的基因編輯可以被允許：缺乏其他合理的選擇對令人信服地證明進行基因編輯可緩解嚴重疾病只轉化為在人群中普遍存在的基因變異，並且已知不存在副作用風險和潛在的健康利益具備可靠的臨床前和臨床數據臨床試驗中持續的嚴格的監督長期多代後續綜合計劃通過公眾健康和社會福利和風險評估。

2017年10月，Cell Stem Cell發表聯合署名的論述文章，綜述了科學界對人類基因編輯尤其是可遺傳的胚胎基因編輯發展的詳細指導意見，同時闡述了人類胚胎基因編輯對於胚胎髮育等基礎研究的重要推動作用，以及國際學術合作對潛在臨床應用的重要意義。並提出人類胚胎基因編輯技術可以有效推動人類胚胎髮育學的研究，倡議對於人類胚胎研究的限制進一步合理放開，科學界將能夠取得更大的成果，這些理解可能在未來幾年對世界範圍內的人類胚胎基因編輯研究提供新的思路和研究基礎，並且提出通過國際合作推動人類胚胎基因編輯中所存在諸多問題的解決。

（2）世界主要國家政府積極構建人類基因編輯的政策框架

自本世紀以來，世界主要國家圍繞人類基因編輯發布了一系列報告，制定了相關監管政策，初步構建了基因編輯政策框架。2016年1月22日，《Science》以《Editing policy to fit the genome?》概述了關於人類基因編輯的政策框架問題，初步匯總了美國、德國、中國、日本等國家關於基因組技術綱要和立法文件。

表1 主要國家基因編輯技術綱要和立法文件

5.我國積極布局基因編輯相關領域研究

我國《「十三五」國家科技創新規劃》、《「十三五」生物技術創新專項規劃》、《「十三五」生物產業發展規劃》、《「十三五」國家戰略性新興產業發展規劃》等一系列規劃中明確重點布局了基因編輯技術的研發與應用。《「十三五」國家科技創新規劃》提出重點發展基因編輯技術等前沿共性技術和基因治療等新型生物醫藥技術，並將基因編輯列為基礎研究和前沿技術的戰略性前瞻性重大科學問題和引領產業變革的顛覆性技術予以重點布局。《「十三五」生物技術創新專項規劃》同樣將新一代基因操作技術列為顛覆性技術，並重點支撐基因治療等現代生物治療技術領域發展。《「十三五」生物產業發展規劃》和《「十三五」國家戰略性新興產業發展規劃》重點布局基因治療技術、高性能基因編輯設備、基於基因編輯技術的生物育種技術的研發，將基因編輯列為前沿核心技術，構建基因組編輯技術為依託的分子育種創新平台，建基因編輯技術體系，開發針對重大遺傳性疾病、感染性疾病、惡性腫瘤等的基因治療新技術，促進基於基因編輯研究的臨床轉化和產業化發展，並支持高端基因合成、基因編輯等專業技術服務機構。

二、基因編輯技術進展

基因編輯技術研究近些年有極大的突破，最新的基因編輯工具能夠在幾乎任何物種中實現精確的修飾，有核苷酸水平的精確度和較快的速度。

1. 典型基因編輯技術發展進程

自上世紀人類基因組計劃以來，基因編輯就受到廣泛關注，並衍生髮展出了眾多基因編輯技術，按照編輯原理可分為如下三類，基於DNA內切酶實現基因組特定位點改造的基因編輯技術，是當前發展最為迅速，關注度和應用範圍最為廣泛的一類基因編輯技術，主要包括鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄激活因子樣效應子（TELEN）和規律成簇的間隔短迴文重複（CRISPR）等技術；基於鹼基互補配對能力和生物信息傳遞中心法則的信息組修飾技術實現基因組多點修飾的基因編輯技術，如CAGE和YOGE技術；基於人工基因組設計合成的特定人工序列（LoxP位點等）實現基因組多位點的刪除、倒置與重複等編輯技術。由於不同基因編輯技術的特點與其相對的不完美，使得眾多學者在該領域不斷探索。時至今日基因編輯技術的探索與改進仍是學界廣為關注的研究熱點。較為公認的是，相對一些小眾的基因編輯技術，當前可以在哺乳動物細胞中近乎任意位點切割並引發編輯的大眾型基因編輯技術主要有三類，分別為ZFN、TALEN以及CRISPR。

基因編輯的過程機制較為複雜、多樣，但基於DNA內切酶實現基因組特定位點改造的基因編輯技術（ZFN、TALEN和CRISPR）總體的技術路徑相似，效率和便利性也逐漸優化，因而被稱為第一代、第二代、第三代基因編輯技術。不同技術的區別在於如何引入斷裂，以及新序列靶定的難易程度。

（1）ZFN

鋅指核酸酶（ZFN）出現20世紀90年代，該技術由鋅指蛋白實現對DNA的識別，由核酸酶進行精準切割，是第一個使用定製DNA核酸內切酶的基因組編輯策略。ZFN是異源二聚體，其中每個亞基含有一個鋅指結構域和一個FokI核酸內切酶結構域。FokI結構域必須二聚化才有活性，確保必須存在兩個相鄰的DNA結合事件才能實現雙鏈斷裂，從而增加了目標特異性。切割事件使得大部分基因組編輯得以實現，在雙鏈斷裂後，細胞通過NHEJ和HDR機制修復的過程中完成基因編輯。經過十幾年的發展，ZFN已應用於多種模式動物實現了基因的修飾。2005年，ZFN還首次實現了對人類細胞基因的定點修飾。然而，ZFN的精確度要建立在龐大的鋅指表達文庫之上，從中篩選出鋅指蛋白，耗時費力，成本也高，至今尚未大規模的應用。ZFN技術最早由Sangamo生物科學公司最早商業化並用來開發治療產品。在科研方面，Sangamo授權給了Sigma-Aldrich。Sigma-Aldrich公司將ZFN技術商業化，推出CompoZr ZFN試劑技術平台。

（2）TELEN

2009年，研究人員發現植物病原體黃色單胞桿菌編碼的轉錄激活因子效應物核酸酶（TALE, transcription activator like effectors）的氨基酸序列與基因組中的核酸序列有恆定的對應關係。TALEN是二聚的轉錄因子/核酸酶，由33至35個氨基酸模塊構成，其中每個模塊可靶定單個核苷酸。通過組裝這些模塊，可靶定目標序列。理論上TALENs可以實現對任意基因序列的編輯，原理與ZFN技術相似，雖然同樣比較繁瑣，但更為靈活，篩選、構建方面也要容易一些，成本也更低，但TALE可能引起機體免疫反應。當前TALEN基因編輯產品工具主要由Addgene、Dan Voytas實驗室、Cellectis Bioresearch公司、Life Technologies公司等開發。

（3）CRISPR

伴隨著對基因打靶技術深入的研究，2012年以來出現了CRISPR/Cas基因編輯系統。該系統主要根據細菌或是古細菌中對外源入侵分子防禦系統改造而成，可通過蛋白質和RNA 的複合物對基因組中特定序列進行切割。在CRISPR/Cas9系統中，Cas核酸酶在DNA位點上產生雙鏈斷裂，而這一位點是由短的嚮導RNA決定的。與其他系統相同，斷裂也通過NHEJ或HDR來修復。與ZFN和TALEN不同的是，CRISPR/Cas系統不是人造的，是細菌天然適應性免疫的一種形式。相比較ZFN和TALEN，CRISPR/Cas更為簡單、價格低廉、易於編程且非常高效，但由於嚮導RNA序列比ZFN或TALEN所靶定的大部分序列更短，這意味著脫靶效應的幾率更高，精確度也不及ZFN和TALEN，但近些年的研究已經極大程度降低脫靶的幾率和提高精確度。

表2 CRISPR基因編輯技術的對比優劣勢

2. 2017年基因編輯技術進展

2017年度，基因編輯技術重要進展主要包括如下4個方面，一是研發出用於RNA編輯的CRISPR編輯工具，二是開發出新一代CRISPR基因編輯工具CRISPR/Cpf1，三是開發出基於CRISPR/Cas9的單條染色體敲除技術，四是CRISPR/Cas9精度和效率提升技術的研發。

（1）可靶向RNA編輯的CRISPR/Cas13工具

RNA編輯是基因編輯技術的一個重要的發展趨勢,2016年以來逐漸受到學界關注。2017年度的重點研究進展聚焦Cas13a酶系統靶向和切割RNA的作用機制、開發出可用於哺乳動物細胞RNA編輯的CRISPR-Cas13a編輯工具並探索研發高通量RNA操縱的編輯工具CRISPR-Cas13b。

中科院研究揭示出VI型CRISPR-Cas13系統的Cas13a抵抗RNA噬菌體的作用機制，從結構上揭示了Cas13a切割RNA機制（Cell）。加州大學的研究論文更為全面的展示了RNA靶向CRISPR酶Cas13a的作用機制，描述了Cas13a酶如何產生功能性crRNAs，以及在靶標RNA識別之前，其催化活性如何被封閉，這將有助於解析細菌免疫系統，以及臨床診斷治療（NatStruct Mol Biol）。MIT的研究證實了Cas13a酶可以高效地切割哺乳動物細胞RNA靶標，並開發出可在哺乳動物細胞中發揮作用CRISPR-Cas13a的RNA編輯工具（Nature）。MIT和哈佛大學論文闡述了靶向RNA的CRISPR酶系統，發現了兩個利用Cas13b酶的新型的RNA靶向CRISPR酶系統，可高通量地方式特異性地靶向操縱RNA（Mol Cell）。

（2）新一代CRISPR基因編輯工具CRISPR/Cpf1

與CRISPR/Cas9編輯系統相比，出現於2015年的CRISPR/Cpf1（也稱作Cas12a）基因編輯系統具有更為高效、靈活和較高的精準度等特點。MIT張鋒在Cell發表CRISPR/Cpf1的綜述，介紹了Cpf1系統比Cas9的進一步優勢：更為簡單，Cas9需要2個RNA分子協助，Cpf1隻需要一個RNA分子；更為靈活，Cpf1酶也比標準SpCas9要小，使得它更易於傳送至細胞和組織內；更為精準，Cpf1系統切割產生黏性末端，便於新DNA序列插入，而Cas9複合物切割DNA時留下的「平端」在重新連接時往往會發生突變；更為高效，Cpf1切口遠離識別位點，這意味著即便在切割位點靶基因突變，仍然可以進行再度切割，提供了多次機會來校正編輯。 2017年度CRISPR/Cpf1的研究進展聚焦在相關機制的進一步闡明。

上海生科院鑒定了Cpf1蛋白的DNA精確切割位點和切割特性，並開發出新的DNA無縫拼接方法（Nucleic Acids Res）。哥本哈根大學的研究從結構上揭示CRISPR-Cpf1的DNA靶向機制，闡述了Cpf1的分子剪刀讓DNA解鏈並進行切割的分子機制，指出Cpf1的主要優勢在於它的高度特異性和DNA切割方式的原理（Nature）。MIT張鋒研究發現了擴展CRISPR/Cpf1的靶點選擇範圍的方法，指出突變AsCpf1和LbCpf1的方法可以擴大了靶點選擇範圍（Nat Biotechnol）。

（3）基於CRISPR/Cas9工具的單條染色體敲除技術

2017年學界開發出了基於CRISPR/Cas9工具的單條染色體敲除技術，進一步拓展了CRISPR/Cas9編輯工具的應用範圍。澳大利達亞特萊特大學採用CRISPR/Cas9體外在41個位點切割Y染色體的著絲粒，可達到80%的Y染色體切割效率，在298個位點上切割Y染色體的長臂會導致95% Y染色體切割效率，實現了小鼠完整染色體的清除（Molecular Therapy）。上海生科院也開發出可選擇性消除單條染色體的CRISPR/Cas9敲除工具，證明了CRISPR/Cas9可在細胞、胚胎或體內組織中選擇性消除單條染色體（Genome Biol）。

（4）CRISPR/Cas9基因編輯工具效率和準確率提升技術

CRISPR/Cas9系統是最早，也是最為成熟的CRISPR基因編輯工具，應用也最為廣泛，相關研究圍繞進一步提升其精度、效率和降低脫靶效應上開發出一系列技術。

美國Broad研究院開發出測序輔助的基因編輯技術，可減少由人體遺傳變異導致CRISPR/Cas9基因編輯系統精度的降低，提出通過採用全基因組測序預篩查和選擇嚮導RNA構建更為有效和安全的CRISPR/Cas9基因編輯工具的技術路徑（Nature Medicine）。更為安全的CRISPR基因編輯技術的研發。德州大學研究同步證實了測序輔助CRISPR編輯工具可通過檢測CRISPR分子評估非CRISPR靶點的潛在相互作用DNA片段，可有效提高基因編輯的安全性（Cell）。

瑞典烏普薩拉大學開發出通過改進Cas9提升特異基因片段搜尋和剪切效率的技術，指出改進Cas9的PAM序列可改善Cas9打開DNA雙螺旋搜索基因的位置和頻率，加速Cas9發現靶序列降低副作用產生的目的（Science）。加州大學的研究證明修正Cas9REC3結構域可大幅降低CRISPR-Cas9的脫靶效應（Nature）。

霍普金斯大學發現了高效CRISPR/Cas9編輯的基因組規則，可有效提升基因編輯的成功率，研究指出線性DNA片段、最佳的同源臂長度（35nt）、適當的切割位點和供者DNA距離（小於30nt）可達到最高的基因編輯成功率（PNAS）。

哈佛大學和MIT研究開發出校正點突變的DNA/RNA鹼基編輯器技術，將有效拓展基因編輯工具的應用範圍。其中哈佛大學的研究提出了一種新的DNA編輯策略，在不切割整個DNA雙螺旋的情況下通過解鏈DNA對點突變鹼基實現編輯（Nature）；而MIT張鋒團隊的研究是通過合成一種新的融合酶實現RNA鹼基編輯（Science）。

三、基因編輯技術在生物醫學研究中應用進展

基因編輯技術工具層面的突飛猛進的發展將快速推動基因編輯技術在生物醫學研究中的廣泛應用，對於生物醫學研究產生重要的變革性的基礎作用。2017年度的主要進展體現在，基因編輯技術已經在人胚胎細胞基因編輯、幹細胞基因編輯、免疫細胞（T細胞）基因編輯、RNA檢測、癌基因篩選、遺傳篩查、藥物靶點篩選和模式動物研究領域廣泛應用，極大程度推進相應領域的變革性發展。

1.胚胎細胞基因編輯

雖然人類胚胎基因編輯面臨較多的技術不確定性和較大的倫理爭議，但學界已經涉足該領域的探索。俄勒岡衛生與科技大學的研究利用CRISPR/Cas9對活的人胚胎進行基因編輯，成功地校正導致心 臟病的MYBPC3基因突變（Nature）。中山大學利用改進型CRISPR/Cas9校正人胚胎導致β-地中海貧血的錯誤單核苷酸序列（Protein & Cell）。

2.幹細胞基因編輯

最新的研究證據表明，幹細胞基因編輯可以極大程度拓展幹細胞的用於臨床診療的可能。中科院利用基因編輯技術編輯幹細胞，獲得了具有對細胞衰老和致瘤性轉化的雙重抵抗作用的遺傳增強「超級」幹細胞，為幹細胞治療提供了可能的解決方案（CellRes）。

3.免疫細胞基因編輯

免疫細胞治療是近兩年生物醫學領域重要的顛覆性技術領域。隨著2017年諾華和Kite兩款腫瘤免疫細胞治療產品CAR-T（嵌合抗原受體T細胞免疫療法）的上市，細胞治療已成為繼傳統化學治療、物理治療和手術治療之後的新一代治療技術。然而，當前免疫細胞治療仍存在諸多技術上的缺陷，而基因編輯技術將有效助力免疫細胞治療的進程。最新的研究顯示TALEN和CRISPR/Cas9均有效用於治療性T細胞基因編輯，其中TALEN技術用於通用型CART細胞製備有望引領新一代CAR-T技術性變革（當前是自體CAR-T細胞治療）。2017年，美國輝瑞與法國施維雅和Cellectis聯合宣布，基於TALEN基因編輯技術的通用型CAR-T細胞療法UCART19用於複發性/難治性急性淋巴細胞白血病（ALL）的治療已進入臨床試驗階段。與自體CAR-T相比該技術有無可比擬的優勢。但同時，Cellectis的另一款通用型CAR-T臨床試驗UCART123的兩項1期臨床試驗由於出現受試者死亡被FDA叫停，通用型CART研究依舊面臨挑戰。

雖然不如TALEN精度高，更為高效、廉價的CRISPR/Cas9基因編輯技術也成功用於抗癌T細胞的改造。斯隆凱特林癌症紀念中心利用CRISPR/Cas9成功構建強效CAR-T細胞，證實CRISPR/Cas9技術能夠運送CAR基因到T細胞基因組中的特定位點上。這種精準的方法能夠更強健地構建出CAR-T細胞，能夠持續更長的時間地殺死腫瘤細胞（Nature）。英國卡迪夫大學利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術對殺傷性T細胞（NK）進行進一步基因改造，將非癌症特異性受體替換為特異性癌細胞的受體，從而實現腫瘤的T細胞治療（Blood）。

4.基於基因編輯技術的RNA檢測

RNA檢測是最為先進的分子生物學技術，基因編輯為RNA檢測提供了更為精準的技術路徑。哈佛大學和MIT開發出基於CRISPR/Cas13a基因編輯技術的的診斷技術平台，可檢測任何RNA分子，靈敏度增加一百萬倍（Science）。加利福尼亞大學開發出採用不同Cas13a樣蛋白（10種Cas13a突變體）實現同時多個RNA分子檢測的技術，為將來高通量RNA檢測奠定基礎（Mol Cell）。

5.基於基因編輯技術的癌基因、藥物靶點篩選和遺傳篩查

由於基因編輯技術有著精準的基因識別和靶向編輯的能力，因此基於基因編輯技術可以開發出高效用於癌基因篩查、藥物靶點篩選和遺傳篩查的技術平台。

雖然既往CRISPR基因編輯工具已經廣泛用於癌基因篩選，但假陽性的問題使得篩選的精度大打折扣，哈佛大學和MIT最新的研究開發出一種用於校正CRISPR癌症基因篩選中假陽性的方法（CERES），CERES的計算方法可有效限制篩查中的假陽性結果，可對彙集的CRISPR篩選數據進行拷貝數效應校正，並且針對癌細胞的基因依賴性提供給一種客觀的證據（NatGenet）。

在基於基因編輯技術的藥物靶點篩選方面，最新的研究進展在於體內篩選技術和高通量的篩選技術。哈佛大學和MIT研究採用體內CRISPR-Cas9基因組編輯技術以篩選可增強PD-1檢查點抑製劑的療效的基因位點（Nature）。劍橋大學的研究證實了CRISPR-Cas9技術可以高效的篩選急性骨髓性白血病細胞中潛在的藥物靶點基因（Nature）。

傳統遺傳篩查依賴於單純的測序技術，精度和效率均較低，最新的研究將基因編輯與測序技術結合用於遺傳篩查可大幅提升精度和效率。哈佛大學開發出基因編輯與側學技術融合高效遺傳篩查技術平台，實現了大規模的單細胞轉錄譜分析（Nature Method）。奧利地科學院的研究開發出CRISPR液滴測序（CROP-seq）技術，實現高通量RNA多種表型的檢測（Nature Method）。

6.基因編輯技術用於模式動物構建

模式動物是生物醫學研究領域最為重要的實驗對象，基因編輯技術用於模式動物的研究可極大程度提高模式動物培育的效率。我國昆明大學用TALEN基因編輯技術成功構建食蟹猴Rett綜合征神經發育性疾病模式動物，可為相關疾病的研究提供重要的動物模型（CELL）。

四、基因編輯在疾病基因治療中的進展

基因治療是基於對細胞內基因修飾的策略來治療各種疾病。單基因疾病是由於鹼基突變引起，可通過恢復基因的表達水平實現疾病的治療；而多基因疾病的治療相對來說比較困難。

基因治療是通過正常基因的導入彌補缺陷基因，傳統技術手段採用病毒載體介導基因導入，其中逆轉錄病毒介導的基因治療首先進入臨床，之後慢病毒、腺病毒、腺相關病毒等也在基因治療中予以應用。雖然諸如逆轉錄病毒一類的治療載體可以將所需目的基因整合到基因組中，持久表達用以代替缺陷基因，但是逆轉錄病毒的整合具有隨機性，存在較多的安全性問題。尋找特異、高效修復的基因打靶工具是基因治療領域中核心瓶頸問題。而基因編輯技術的出現和應用為基因治療提供有力的工具。

當前，基於基因編輯技術的基因治療主要包括體外編輯回輸體內和體內編輯兩類。與傳統基因治療方法相比，基因編輯技術能在基因組水平上對DNA序列進行改造，從而修復遺傳缺陷或者改變細胞功能，使得徹底治癒白血病、艾滋病和血友病等惡性疾病成為可能。

最新的研究顯示，基於ZFN基因編輯技術的單基因遺傳病的治療已經進入人體臨床試驗階段，CRISPR/Cas9基因編輯技術對特定基因組DNA的定位也逐漸更加精準，成本更加低廉，在遺傳性疾病、眼科疾病、腫瘤、血液病等基因治療中的應用逐漸廣泛，逐漸成為其主流技術，並推動了基因治療領域的快速發展。

1.基因編輯已進入人體臨床試驗階段

既往基因編輯的疾病治療的研究均在細胞和動物體內展開， 2017年度美國Sangamo 治療公司（Sangamo Therapeutics）宣布針對部分單基因遺傳病開展人體臨床試驗和體內基因編輯試驗，標誌著基因編輯已進入人體試驗階段。

Sangamo 治療公司於2017年5月份招募血友病 B、赫勒綜合征、亨特綜合征患者，開展基因編輯臨床試驗。臨床試驗通過腺相關病毒（AAV）為載體的鋅指核酸酶（ZFN）在人肝細胞中的白蛋白編碼基因的靶位點上進行切割，隨後這種基因的一種功能性拷貝通過同源重組而被整合到肝細胞的基因組中，從而進行治療。11月份，Sangamo公司報道完成了針對亨特氏綜合征的1例體內基因編輯治療臨床試驗，治療效果有待進一步觀察。

2.基於CRISPR編輯技術的單基因遺傳病治療

在單基因遺傳病基因治療領域，最新的研究重點聚焦更為簡單廉價的CRISPR編輯技術的應用。美國過敏與感染疾病研究所（NIAID）採用CRISPR-Cas9基因編輯技術通過體外靶向和修復源自X連鎖慢性肉芽腫病患者體造血幹細胞中的缺陷基因（CYBB），並將編輯後造血幹細胞移植至體內實現這些經過修復的造血幹細胞產生了功能正常的白細胞（Sc Trans Med）。德州大學使用CRISPR/Cpf1（另一種CRISPR基因編輯系統，Cpf1比Cas9酶小很多）基因編輯系統，在人類心肌細胞和動物模型中實現了杜氏肌營養不良突破基因的靶向和基因修復（Science Advances）。美國埃默里大學在亨丁頓舞蹈症模式小鼠中利用通過病毒載體運送的CRISPR/Cas9成功切除腦細胞mHTT基因的一部分，使得亨廷頓蛋白聚集物幾乎消失了（JCI）。

3.基因編輯用於眼科疾病治療

最新的研究圍繞基於CRISPR基因編輯技術的遺傳性視網膜病、視網膜黃斑變性、青光眼等眼科疾病治療，並取得重要進展。

美國國立健康研究院採用腺病毒為載體的CRISPR/Cas9基因編輯系統，靶向敲除小鼠視網膜細胞Nrl基因，可有效緩解色素性視網膜炎視網膜退化（Nat Commun）。韓國基礎科學研究所採用腺相關病毒攜帶CRISPR/Cas9在小鼠體內實現失明的基因修飾，成功治療相關遺傳性視網膜疾病（NatCommun）；該機構的另外一項研究將CRISPR/Cas9複合物注射到濕性黃斑變性模式小鼠的眼睛中，對VEGF基因進行局部修飾，有效控制了網膜和鞏膜之間形成新的血管的生成（GenomeRes）。MIT的研究同樣證實了利用腺相關病毒（AAV）運送靶向VEGFR2基因的CRISPR/Cas9系統可成功地阻止視網膜中的血管生成的技術機制（Nat Commun）。愛荷華大學利用CRISPR/CAS9技術將突變的肌纖蛋白進行了敲除，有效緩解廣角青光眼（PNAS）。

4.基因編輯探索用於艾滋病、腫瘤等疾病治療

作為一種全新的治療路徑，除在單基因遺傳病、眼科疾病等領域治療研究外，最新的研究探索將基因編輯技術用於艾滋病、腫瘤、血液病等治療領域，並取得初步進展。

北京大學通過CRISPR/Cas9靶向人胎兒肝臟造血幹細胞CCR5基因發生突變，進而移植到小鼠體內後可阻斷HIV感染（Molecular Therapy），研究提示基因編輯技術或可成為HIV治療的全新路徑。

在腫瘤和血液病治療方面。匹茲堡大學開發出病毒遞送CRISPR/Cas9靶向敲除融合基因突變DNA序列，並用癌細胞死亡基因替代，從而殺滅癌細胞（NatureBiotechnology）。紀念斯隆—凱特琳癌症採用CRISPR-Cas9技術構建了更有效的CAR-T細胞，顯著提升腫瘤免疫治療效果（Nature）。澳大利亞南威爾士大學探索利用CRISPR基因編輯技術將有益自然突變引入到血細胞中，有效扭轉血液病，為鐮狀細胞性貧血和其他的血液疾病的基因治療提供重要方法路徑（Blood）。

五、基因編輯產業化發展

基因編輯技術的快速發展催生了一系列技術的產品化，除了傳統的基因和生物技術公司，如Sangamo生物科學公司、Sigma-Aldrich和Cellectis Bioresearch公司等，近些年出現了一批專註基因編輯的新的初創型科技企業，也受到了金融資本的關注（表3）。與此同時，基於基因編輯技術的疾病治療方案的開發引起了眾多知名企業的關注，諾華、輝瑞、Juno等通過投資等方式紛紛與基因治療公司開展合作，以推動基因編輯技術在疾病治療中的快速應用發展。我國在基因編輯方面尚未有商業化和產業化的公司，這與我國在基因編輯技術本身研發上缺少原創性的技術成果有關。

表3 世界主要基因編輯公司

六、展望

當前，作為生命科學核心基礎性技術的基因編輯技術已經初步成熟，並快速得到政府、學界和產業界廣泛關注。雖然基因編輯技術有較多的技術不可控和安全及倫理風險問題，但由於基因編輯技術的本身的拓展性極為廣泛，學界和產業界擔任了技術推動的先鋒，國家在技術監管和風險防控上面均保持高度的謹慎和持續的跟進。

在科技計劃推進上，國際學界的基因編寫計劃2016年初漏端倪，而美國NIH直到2018年1月份才發布報告擬通過共同基金來支持基因編輯技術的研究與基因治療中的應用。

未來，基因編輯技術所開啟的生命體基因水平的操縱和研究的時代將快速來臨，或許將從根本上為遺傳性疾病、腫瘤等一系列重大疾病的治療提供新的工具和路徑。

作者丨賈曉峰 中國科學技術信息研究所

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