2018年10月CRISPR/Cas最新研究進展

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基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短迴文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。

即將過去的10月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報道的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。

1.Science子刊：發現一種新的Cas9能夠靶向基因組中將近一半的位點

doi:10.1126/sciadv.aau0766

作為一種最廣泛使用的Cas9酶，來自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpCas9）的PAM序列為5′-NGG-3′。在這種PAM序列中，兩個連續的鹼基G的存在顯著地限制了SpCas9能夠靶向的位點數量，僅占基因組上的大約9.9%的位點。到目前為止，只有少數CRISPR酶具有最低的PAM要求，這意味著它們能夠靶向更廣泛的位點。

圖片來自Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aau0766。

如今，在一項新的研究中，來自美國麻省理工學院的研究人員發現一種Cas9酶能夠靶向基因組中幾乎一半的位點，從而顯著了拓寬它的潛在使用。相關研究結果發表在2018年10月24日的期刊上，論文標題為「Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog」。他們最終發現他們尋找的一種最成功的酶為來自犬鏈球菌（Streptococcus canis）的Cas9（ScCas9），它與已經廣泛使用的SpCas9酶非常相似。ScCas9看起來與SpCas9幾乎完全相同，但是它能夠靶向SpCas9不能夠靶向的靶DNA序列。ScCas9的PAM序列為5′-NNGTT-3′。在這種PAM序列中，僅存在一個鹼基G，這就允許ScCas9要比SpCas9靶向基因組中更多的位點：占基因組中將近一半的位點。

2.Science：重磅！發現迄今為止最小的功能性CRISPR系統---CRISPR-Cas14

doi:10.1126/science.aav4294

一群古老的包含地球上一些最小生命形式的微生物也擁有迄今為止發現的最小的CRISPR基因編輯系統。在這種基因編輯系統中，一種稱為Cas14的蛋白與Cas9存在著親緣關係，但在大小上僅為後者的三分之一。Cas9是革命性基因編輯工具CRISPR-Cas9中的一個發揮作用的蛋白組分。

雖然Cas9是從細菌中分離出來的，但是Cas14是在一群古細菌---細菌的原始親屬---的基因組中發現的。Cas9和其他的Cas蛋白是細菌進化出來的保護自己免受病毒入侵的防禦系統的一部分。作為靶向酶，它們非常有選擇性地尋找和結合細菌中的特定DNA或RNA序列，即那些與CRISPR記憶庫中儲存的序列相匹配的DNA或RNA序列，隨後切割這種DNA或RNA序列，從而阻止新的病毒入侵者。與Cas9一樣，Cas14具有作為生物技術工具的潛力。由於具有較小的體積，Cas14可能用於編輯小細胞或某些病毒中的基因。不過鑒於它的單鏈DNA切割活性，它更有可能改善目前正在開發的用於快速診斷傳染病、基因突變和癌症的CRISPR診斷系統。

Cas14與Cas12和Cas13相類似，這是因為在結合到它的靶DNA序列上後，它開始不加選擇地切割細胞內的所有單鏈DNA。相反，Cas9僅結合併切割靶雙鏈DNA。不加選擇地切割單鏈DNA可能是治療中的一種缺點，但在診斷方面具有很大的優勢。Cas14蛋白可與附著在單鏈DNA片段上的熒游標記物組合使用。當Cas14與它的靶DNA序列（一種癌基因或傳染性細菌中的一種基因）結合併開始切割DNA時，它也會切割與這種熒游標記物連接在一起的單鏈DNA片段，從而產生熒光信號。

作為Harrington的一名同事，Janice Chen補充道，「Cas14以比Cas12更特異性的方式靶向單鏈DNA。這真地是一個非常意外的發現。這是因為它太小了，我們幾乎認為它無法發揮作用，但是實際上，它是超級特異性的，這使得它成為診斷工具箱的一個非常強大的補充。」

Harrington、Chen及其同事們（包括CRISPR-Cas9發明人、加州大學伯克利分校分子與細胞生物學教授Jennifer Doudna），已對Cas14進行改進，使得它能夠用於當前使用Cas12和Cas13快速檢測傳染性生物和基因突變存在的診斷系統（稱為DETECTR）之中（Science, Published Online: 15 Feb 2018, doi:10.1126/science.aar6245）。Harrington、Doudna和Chen是一家名為Mammoth Biosciences的公司的聯合創始人，該公司正在將DETECTR商業化。

3.Cell：突破！科學家利用新型基因條形碼技術鑒別出關鍵的癌症免疫基因

doi:10.1016/j.cell.2018.09.022

近日，一項刊登在國際雜誌Cell上的研究報告中，來自西奈山醫院的科學家們通過研究開發了一種能同時分析成百上千個基因功能的新型技術，該技術的解析度能達到單細胞水平，其依賴於一種使用新型蛋白質的條形碼技術。

圖片來源：CC0 Public Domain

研究人員就開發了一種新技術，其能以一種前所未有的規模來分析基因組，這或許就能夠解決當前科學家們所面臨的基因組學研究上的挑戰。這種新工具能夠利用名為表位的合成蛋白來貼上條形碼並且追蹤不同的CRISPRs，這種蛋白質條形碼被稱為優先代碼（pro-code），其能夠使得數百個CRISPRs一起來敲除大量基因。

當前有很多技術能夠聚合CRISPRs，這些方法在很大程度上依賴於DNA作為條形碼，並且只允許對基因功能進行較低解析度的研究；而通過這種優先代碼技術，研究人員就能夠提供一種新方法來幫助科學家們深入理解基因的功能和生物學效應。文章中，研究人員利用優先代碼技術搜尋了免疫系統保護機體抵禦癌症所需要的基因，隨後他們利用CRISPRs來靶向剔除推測的免疫調節基因，並將其與優先代碼配對，隨後將這種優先代碼/CRISPRs (Pro-Code/CRISPR)文庫引入到乳腺癌細胞中，這些腫瘤就會受到識別癌細胞的殺傷性T細胞的攻擊和挑戰，很多癌細胞就會被T細胞快速消滅，但有些癌細胞卻會產生一定的耐受性。

4.Cell：重大進展！開發出讓基因組重新組裝的CRISPR-GO技術

doi:10.1016/j.cell.2018.09.013

在一項新的研究中，來自美國斯坦福大學的研究人員通過解除CRISPR-Cas9的「切割」功能，這種編輯工具變得更像是一種遞送系統，這樣就能夠通過可編程的嚮導RNA（gRNA）將DNA片段遞送到細胞核中的新位置上。這種稱為CRISPR-基因組組裝（CRISPR-genome organization, CRISPR-GO）的新技術使用一種經過修飾的CRISPR蛋白，從而在三維空間中重新組裝基因組。如果CRISPR-Cas9像分子剪刀一樣，那麼CRISPR-GO就像分子鑷子一樣，抓住基因組中的特定部分，並且將它們放置在細胞核的新位置上。但是這並不僅僅是物理上的重新安置：改變DNA片段的位置能夠改變它們的運作方式。相關研究結果於2018年10月11日在線發表在Cell期刊上，論文標題為「CRISPR-Mediated Programmable 3D Genome Positioning and Nuclear Organization」。論文通信作者為斯坦福大學化學與系統生物學助理教授Lei S. Qi博士。

CRISPR-GO有三個基本部分。首先，你想要重新定位的靶DNA片段所在的「地址」---一段DNA，它能夠靶向一條互補的結合RNA的鏈。其次，你需要目標地址---你想要將染色質移動到的細胞核區室中的特定DNA部分。最後，還存在「橋（bridge）」，在這種情形下，它是一種催化劑，它促進靶DNA片段移動到它在細胞核中的目標地址。

通過使用CRISPR-GO，這些研究人員觀察到重新定位到卡哈爾體（Cajal body）---作為細胞核中的一部分，它是一團無定形的且有些神秘的蛋白和RNA ---中的基因停止表達蛋白。他們首次有證據證實卡哈爾體能夠具有直接的基因調節作用。這提示著卡哈爾體在控制轉錄方面有一些意想不到的作用。

當Qi利用CRISPR-GO將端粒DNA ---染色體上的與長壽相關的分子帽---從細胞核的中間移動到細胞核的邊緣時，端粒停止生長，從而阻止細胞周期和降低細胞活力。然而，當端粒更靠近卡哈爾體時，相反的情形發生了：它們生長，並且通過這樣做，細胞活力也增加了。 CRISPR-GO的第三種應用是形成早幼粒細胞白血病小體（promyelocytic leukemia body, PML小體）。眾所周知，這種蛋白團塊抑制促腫瘤基因表達。通過將它放置在細胞核中的致癌基因附近，Qi計劃測試它是否能夠有助於抑制腫瘤形成。

5.Nat Med：鹼基編輯器取得重大進展！有望在產前治療先天性疾病

doi:10.1038/s41591-018-0184-6; doi:10.1038/s41591-018-0215-3

在一項新的研究中，來自美國費城兒童醫院和賓夕法尼亞大學佩雷爾曼醫學院的研究人員首次進行產前基因編輯來阻止實驗室動物出現致命性的代謝障礙，從而有潛力在出生前治療人類先天性疾病。這就為在產前利用一種複雜的低毒的工具高效地對致病性基因中的DNA鹼基進行編輯提供了概念驗證。相關研究結果發表在2018年10月的Nature Medicine期刊上，論文標題為「In utero CRISPR-mediated therapeutic editing of metabolic genes」。論文通信作者為賓夕法尼亞大學佩雷爾曼醫學院的Kiran Musunuru博士 和William H. Peranteau博士。

這些研究人員使用了基因編輯工具CRISPR-Cas9和第三代鹼基編輯器（base editor 3, BE3）靶向編輯一種調節膽固醇水平的基因，從而降低了在子宮內接受過這種治療的健康小鼠中的膽固醇水平。他們還在一小部分事先經過基因改造而攜帶著導致一種致命性肝臟疾病---1型遺傳性酪氨酸血症（hereditary tyrosinemia type 1, HT1）---的突變的小鼠中使用產前基因編輯來改善它們的肝臟功能和阻止新生小鼠死亡。

6.Nat Med：在體內利用新型鹼基編輯器有望治療遺傳疾病

doi:10.1038/s41591-018-0209-1; doi:10.1038/s41591-018-0215-3

苯丙酮尿症（phenylketonuria）的病因是編碼苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase, Pah）的基因發生突變。這種由肝細胞產生的酶代謝苯丙氨酸。這種代謝障礙是一種「常染色體隱性」遺傳疾病：兒童如果從母親那裡遺傳一個突變基因拷貝和從父親那裡遺傳一個突變基因拷貝，那麼就會患上這種疾病。到目前為止，這種疾病仍然是無法治癒的。

在一項新的研究中，來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院和蘇黎世大學的研究人員利用一種方法糾正肝細胞中的兩個突變基因拷貝，從而治癒這種疾病。他們取得成功，至少是在小鼠體內。相關研究結果發表在2018年10月的Nature Medicine期刊上，論文標題為「Treatment of a metabolic liver disease by in vivo genome base editing in adult mice」。論文通信作者為蘇黎世聯邦理工學院的Gerald Schwank教授。

這種由胞苷脫氨酶（cytidine deaminase）加以強化的CRISPR/Cas9系統結合到這兩個需要被校正的基因拷貝上，並且在局部打開DNA雙鏈。胞苷脫氨酶將致病性的DNA鹼基對C-G轉化為健康人體內對應基因組位點上存在的鹼基對T-A。這能夠校正Pah酶編碼基因中的DNA鹼基錯誤。通過這種方法，這些研究人員改變了成年小鼠中這兩個突變基因拷貝中的鹼基序列。這些經過校正的肝細胞能夠產生功能性的Pah酶，這些小鼠所患的這種疾病被治癒了。

7.新研究挑戰用於構建條件性基因敲除小鼠的CRISPR方法

doi:10.1101/393231

在一項新的研究中，一個由全球17個實驗室組成的聯盟提供的結果與一項高度引用的研究（Cell, 12 September 2013, doi:10.1016/j.cell.2013.08.022）---它描述了一種利用CRISPR構建條件性基因敲除小鼠的技術---相矛盾。這項新的研究表明與那項原始的研究相比，這種技術的效率要低得多。相關研究結果[2]於2018年9月1日發表在預印本伺服器bioRxiv上，論文標題為「Re-Evaluating One-step Generation of Mice Carrying Conditional Alleles by CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing Technology」。

圖片來自bioRxiv, doi:10.1101/393231。

這項新研究的結果指出了那項原始研究的局限性，後者取得的成功似乎被歸因為剔除雜合小鼠品系中的特定基因。根據谷歌學者（Google Scholar）網站的統計，那項原始研究被引用了將近1000次。它的主要作者堅持認為他的方法是強有力的。

在學術會議和其他地方，一個緊密結合的研究團體針對其他實驗室利用這種技術所面臨的挑戰開展的討論使得主管澳大利亞國立大學轉基因機構的Gaetan Burgio和他的同事們試圖確定出了什麼問題。

首先，三個實驗室在不同的小鼠品系中複製了這項靶向同一個基因的原始實驗，但沒有取得成功。接下來，包括這三個實驗室在內的17個實驗室在5種不同的小鼠品系中針對小鼠基因組中的總共56個基因和2個基因間區域獨立地重複這項實驗。來自所有這些實驗室的數據集經合併後包括17887個顯微注射或電穿孔的小鼠受精卵和產生的1718隻活小鼠，其中僅15隻小鼠具有條件性對照所需的兩個插入的LoxP位點。在所有接受測試的小鼠中，觀察到脫靶的缺失或突變代替LoxP位點的正確插入。

與那項原始研究在小鼠中獲得條件性敲除等位基因的效率為16％相比，Burgio和其他人的成功率僅為0.87％。

8.Nature：利用CRISPR/Cas系統開發出一種存儲轉錄事件的細胞記錄設備

doi:10.1038/s41586-018-0569-1

在一項新的研究中，來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院和巴塞爾大學的研究人員利用CRISPR-Cas系統開發出一種新的記錄設備：它產生的DNA片段能夠提供關於某些細胞過程的信息。在未來，這種細胞存儲設備甚至可能用於診斷中。相關研究結果於2018年10月3日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Transcriptional recording by CRISPR spacer acquisition from RNA」。

這些研究人員利用腸道細菌大腸桿菌開展研究，將來自一種不同的細菌物種的編碼CRISPR-Cas系統的基因導入到大腸桿菌中。其中的一個Cas基因與一種逆轉錄酶融合在一起，其中逆轉錄酶是利用mRNA分子產生編碼相同信息的DNA ---換句話說，它將mRNA逆轉錄為DNA。

導入這些編碼CRISPR-Cas的外源基因的大腸桿菌細胞能夠產生一種結合短mRNA分子的蛋白複合物。這種逆轉錄酶將mRNA翻譯為含有與初始的mRNA相同的遺傳信息的DNA，然後將它們作為間隔序列存儲在CRISPR陣列中。這種過程能夠多次發生，從而使得新的間隔序列以相反的時間順序添加到CRISPR陣列，因此最近獲得的DNA片段總是位於最前面。

作為他們研究的一部分，這些研究人員記錄了配備有這種數據記錄器的大腸桿菌對除草劑百草枯作出的反應。這種除草劑引起細胞內mRNA轉錄發生變化，這樣他們就能夠在接觸除草劑幾天後從CRISPR陣列中讀出這種反應。如果沒有這種數據記錄器，大腸桿菌與這種除草劑接觸的任何分子痕迹早就會被破壞，這種信息也就丟失了。

9.Nat Biotechnol：利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術從頭培育出新的作物品種

doi:10.1038/nbt.4272

在一項新的研究中，來自巴西、美國和德國的研究人員首次使用CRISPR-Cas9（一種現代的基因組編輯過程）在一代中就利用野生植物中培育出新的作物。從野生番茄開始，他們引入了多種作物的性狀，同時又不會喪失這種野生植物的寶貴遺傳特性。相關研究結果於2018年10月1日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為「De novo domestication of wild tomato using genome editing」。

圖片來自Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4272。

作為親本植物物種，這些研究人員選擇了醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium），它是來自南美洲的野生番茄，也是現代栽培番茄的祖先。這種野生植物的果實只有豌豆的大小，產量低---這兩種特性使它不適合作為作物。另一方面，它的果實比現代的西紅柿更芳香，這是因為現代的西紅柿由於育種而失去了一些味道。此外，這種野生果實含有更多的番茄紅素（lycopene）。這種所謂的自由基清除劑被認為是一種有價值的抗氧化劑。

這些研究人員通過使用多重CRISPR-Cas9修飾這種野生植物，從而使得後代植物的6個基因發生較小的遺傳修飾。這些決定性基因被認為是這種現代的馴化番茄特徵的遺傳關鍵。具體而言，他們對這種野生番茄的基因組進行了以下修飾而培育出新的品種：這種新品種的果實比這種野生番茄大三倍，這相當於櫻桃番茄的大小。這種新品種的果實產量增加了10倍，而且它們的形狀是橢圓形的，相比之下，這種野生番茄的果實是圓形的。這種屬性很受歡迎，這是因為當下雨時，圓形果實比橢圓形果實更快地分開。這種經過基因修飾的野生番茄也具有更緊湊的生長。

10.Nature子刊：開發出CHAOS方法阻止抗生素耐藥性超級細菌產生

doi:10.1038/s42003-018-0135-2

為了開發出可持續的長期解決方案，來自科羅拉多大學博爾德分校的研究人員在一項新的研究中，開發出一種CHAOS（Controlled Hindrance of Adaptation of OrganismS, 控制和阻止有機體的適應性）方法：利用CRISPR DNA編輯技術對細菌細胞內的多種基因表達進行修飾，從而阻止細菌性病原體中的這個至關重要的適應過程和破壞它進化出防禦的能力。這些研究結果可能開闢了關於如何最好地限制細菌抗生素耐藥性產生的新研究途徑。相關研究結果近期發表在Communications Biology期刊上，論文標題為「Multiplexed deactivated CRISPR-Cas9 gene expression perturbations deter bacterial adaptation by inducing negative epistasis」。論文第一作者為科羅拉多大學博爾德分校化學與生物工程系研究員Peter Otoupal。

2013年，Otoupal和他的同事們開始尋找能夠作為大腸桿菌的細胞殺傷開關的基因。當他們一次調整一個基因時，這種細菌能夠適應並存活下來。但是當他們一次改變兩個或多個基因時，這些細菌細胞變弱了。這種CHAOS方法利用這種效應，調整多個基因的表達，從而增加細菌細胞的壓力並最終引發連鎖反應，使得它們更容易受到當前藥物治療的影響。這種技術不會改變細菌的DNA本身，僅會改變多個基因的表達。

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