Science：利用單細胞分析揭示蠑螈再生肢體機制

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美西螈（Ambystoma mexicanum, 也稱鈍口螈，六角恐龍）和其他的蠑螈是唯一能夠再生全肢的四足動物。在這個複雜的過程中，基因表達的變化調節著新的附屬肢體長出，但是人們對損傷如何誘導肢體細胞形成能夠分化為多種細胞類型的再生性祖細胞知之甚少。在肢體再生過程中，對單個細胞進行追蹤和分子分析將會鑒定出不同的分化途徑，並為細胞如何從成熟的靜息狀態轉變為再生性細胞譜系提供線索。

美西螈的肢體由許多不同的細胞類型組成，這些細胞類型源自神經細胞譜系、肌源性細胞譜系、表皮細胞譜系和結締組織（connective tissue, CT）細胞譜系。肢體截肢後，來自截肢平面附近的細胞聚集在一個稱為芽基（blastema）的獨特組織中，芽基起著作為再生新肢體的祖細胞來源的作用。

在一種轉基因美西螈品系中，不同的成體細胞類型的後代能夠在再生過程中被標記、追蹤和分離出來，這就為理解特定的細胞譜系在芽基形成和隨後的肢體再生期間是如何發育的提供了機會。將轉基因美西螈品系與單細胞RNA測序（scRNA-seq）相結合能夠追蹤單個細胞類型，以及重建這些特定的細胞譜系的再生過程背後的分子步驟。

圖片來自Science, doi:10.1126/science.aaq0681。

作為側板中胚層（lateral plate mesoderm）的後代，CT細胞是最為豐富的細胞譜系，有助於促進芽基產生，並且包圍著骨骼和軟骨、肌腱、骨骼外周（periskeleton）以及真皮成纖維細胞和間質成纖維細胞。這些細胞檢測截肢部位所在的位置，導致適當的肢體部分再生，從而使得CT細胞成為破譯和理解再生分子程序的關鍵細胞譜系。

在一項新的研究中，德國研究人員採用一種誘導型Cre-loxP熒光系統建立遺傳標記的轉基因美西螈品系用於分離成體肢體組織中的CT細胞和芽基中的CT細胞後代。他們利用scRNA-seq沿著芽基形成和再生胳膊長出的密集時間過程以及胚胎肢體的發育階段對CT細胞進行分子分析。這種分子分析表明CT細胞表達一進入誘導再生時就失去的成體表型。這種源自CT細胞的異質細胞群體會聚到一種均勻而又短暫的芽基祖細胞狀態，這種狀態在後面的階段能夠重現胚胎肢體出芽樣程序。相關研究結果發表在2018年10月26日的Science期刊上，論文標題為「Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration」。

值得注意的是，這些研究人員並沒有在成熟的胳膊中發現CT幹細胞或芽基樣前體細胞存在的證據。他們發現CT細胞亞型對再生胳膊中的近端隔室和遠端隔室作出空間限制的貢獻。具體而言，一種特定的CT細胞亞型---骨骼外周細胞（periskeletal cell）---在截肢部位延伸切斷的骨骼，然而成纖維細胞性的CT細胞從頭再生遠端的骨骼節段。

通過使用高通量單細胞轉錄組學分析和一種基於美西螈的腦彩虹克隆譜系追蹤技術，這些研究人員能夠在再生的最後階段追蹤CT細胞譜系的再分化軌跡。

這些發現確立了多能骨骼祖細胞（multipotent skeletal progenitor cell）的形成，而這些多能骨骼祖細胞導致肌腱、韌帶、骨骼、骨骼外周和成纖維細胞產生。

綜上所述，CT細胞是理解肢體再生的關鍵細胞類型，這是因為它們形成圖案化的肢體骨骼，從而指導其他肢體組織（比如肌肉）的再生。鑒於CT細胞的異質性以及與其他細胞類型混合在一起，人們通常很難研究CT細胞如何形成再生性芽基細胞。對這些新培育出的轉基因美西螈報告品系的使用，再結合單細胞轉錄組學分析和克隆追蹤，允許這些研究人員確定出當具有不同分子特徵的CT細胞去分化為一種常見的類似於胚胎肢芽細胞的多能祖細胞時，它們經歷一種獨特的分子狀態。

在未來，測試這種過渡狀態中的哪些組分是這種去分化過程所必需的將是比較重要的。此外，這項研究為探究再生相關基因及其相關的染色質結構在這種過渡過程中如何受到調節提供了可能性。最後，這項研究也提供了這樣的一種可能性：在哺乳動物動物中觀察到的有限再生能力是由於無法將CT細胞重編程到這樣的胚胎狀態。

參考資料：

Tobias Gerber1,*, Prayag Murawala2,3,*,?,?, Dunja Knapp et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science, 26 October 2018, 362(6413):eaaq0681, doi:10.1126/science.aaq0681.

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