重磅！TMB終被寫入最新NCCN指南！深度解密TMB何以成為癌症免疫治療最大助力｜臨床大發現

2018年，隨著O葯和K葯相繼在中國獲批上市，中國的資本和葯企對靶向PD-1/PD-L1的免疫治療的熱情達到了巔峰，大量的葯企在開展相關的臨床研究，一度出現沒有足夠的醫生和患者參與臨床研究的局面。

火熱的另一面是，雖然PD-1抗體對實體瘤表現出良好的療效，但是當面對每個獨立的癌症患者時，沒有任何一個科學家或醫生能確定PD-1抗體對這個患者是否有效。

我們手握特效藥，卻缺少有效的篩選患者的方法。

1943年，當Ludwik Gross博士將小鼠身上的腫瘤切除，再把相同的癌細胞移植到同一隻小鼠身上之後，他意外地發現小鼠竟然沒有再長出腫瘤[1]。

也就是在那個時間點，很多科學家意識到免疫系統應該可以識別癌細胞，並殺死它。藉助免疫系統治療癌症的種子在那一刻埋在了科學家的心中。

在隨後的50多年裡，科學家在免疫細胞表面上發現了識別抗原的主要組織相容性複合體分子[2]，在癌細胞表面發現了許多因基因突變產生的新抗原[3-8]。

免疫細胞識別癌細胞的秘密被揭開了。

處於世紀之交的2000年，參與CTLA-4抗體研發的醫生和科學家，在轉移性黑色素瘤患者身上，首次見證了免疫抑制解除後，免疫細胞識別並殺死癌細胞的強大威力。

不過，這種效果能否在其他癌種中復現，當時科學家並不確定。因為在那時，是不是所有的癌種都攜帶有能被免疫細胞識別的新抗原，以及攜帶多少還是未知數。

好在基因測序技術的成熟，幫助科學家解答了上述問題。

2007年，在11家頂級研究機構的通力合作下，腸癌和乳腺癌的全外顯子測序數據發布[9]。2008年，首份腫瘤全基因組測序數據發布[10]。

同年，腫瘤學領域兩位鼎鼎大名的科學家James Allison和Bert Vogelstein帶隊，將乳腺癌和結直腸癌的測序數據用尋找新抗原的演算法分析，在乳腺癌和腸癌組織中發現大量的新抗原[11]。於是他們提出，由於癌細胞在發展的過程中不斷積累新的突變，因此所有的癌症都有可能形成免疫系統能識別的新抗原。

隨後大量研究證明，大量的癌種攜帶基因突變帶來的新抗原[12]。如此看來免疫治療大有可為。

2010年，FDA批准首個免疫檢查點抑製劑ipilimumab用於治療黑色素瘤[13]。

4年之後，PD-1抗體nivolumab和pembrolizumab先後上市，徹底給癌症的治療打開了另一扇大門。

這是人類抗癌史上重要的里程碑事件，也是人類抗癌技術升級的重要轉折點。

一個新的時代開始了。不過一切並沒有那麼容易。

雖然CTLA-4抗體和PD-1抗體顯示出了良好的抗癌效果，但是當此之時，由於缺少有效的患者篩選手段，導致從治療中獲益的患者佔比非常低。

儘管一些研究已經確定了免疫檢查點抑製劑的抗癌效果與外周血淋巴細胞計數，T細胞活化標誌物[14]，「炎症」微環境[15，16]和維持高頻的T細胞受體克隆型[17]之間有相關性。

不過，這些方法的篩選效果並不能令人滿意。故而，患者從免疫檢查點抑製劑的治療中獲益的分子決定因素究竟是啥？這個問題迫在眉睫。

在搞清楚這個問題之前，我們得看看在免疫治療的過程中，抗腫瘤的T細胞和癌細胞如何做到「一個願打一個願挨」。

首先，「打鐵還需身子硬」，T細胞要想殺癌細胞，自己必須得活躍起來；要不然，T細胞就壓根沒有狙擊癌細胞的能力。其次，一個「欠揍」的癌細胞必須得有足夠撩T細胞的新抗原；如果新抗原不足，T細胞就極有可能認為面前的癌細胞是某個正常細胞在偶爾使壞，就對它視而不見了。

身上紋成這樣的，一看就不是好細胞啊

這個紋身的是好是壞？傻傻分不清楚

也就是說，在實際應用中，我們可以從T細胞的活性和癌細胞的免疫原性（新抗原），這兩個角度去預測免疫治療的效果。

先從T細胞的活性說起。我們都知道癌細胞通過表達PD-1的受體PD-L1抑制T細胞的活性。而且科學家也在許多不同的腫瘤組織中發現PD-L1高表達，而且與患者的預後差有關。而且研究人員也在多個PD-1抗體的臨床研究中注意到，治療前腫瘤組織中的PD-L1水平與治療的效果有關[18，19]。後來前瞻性的臨床研究也證實，腫瘤組織中PD-L1的表達水平確實是預測PD-1抗體治療效果的標誌物[20]。

基於上述研究結果，2015年10月2日，FDA批准pembrolizumab治療晚期（轉移性）非小細胞肺癌（NSCLC）時，首次將PD-L1的表達水平作為標誌物。隨後，PD-1抗體的很多適應症獲批，都將PD-L1的表達水平作為一個治療標準。

不過遺憾的是，PD-L1的表達水平也不能總是奏效，背後的原因也鮮為人知。不過，此時或許可以轉而考慮癌細胞表面的新抗原。

通常來講，癌細胞的新抗原是基因突變導致的。癌細胞獲得突變的方式有很多，例如紫外線、輻射、香煙煙霧等物理和化學方式會導致體細胞突變；DNA複製或DNA錯配修復路徑缺陷（mismatch repair deficient ，dMMR）會導致基因組的不穩定，致使突變積累或出現微衛星不穩定（Microsatellite instability, MSI）。

免疫治療與dMMR

2013年，Evan J. Lipson等用PD-1抗體pembrolizumab開展的一個研究讓他們意識到：PD-1抗體對攜帶dMMR的癌症患者可能更有效[21]。

2015年，約翰霍普金斯醫學院癌症學家Luis Alberto Diaz, Jr.團隊通過一項前瞻性研究[22]，證實了Evan J. Lipson的猜想。在dMMR腸癌患者中，免疫治療的客觀響應率是40%，無進展生存率是78%；而在沒有dMMR腸癌患者中，客觀響應率是0%，無進展生存率是11%。這個研究表明，dMMR可以作為PD-1抗體療效預測指標。

2017年，pembrolizumab和nivolumab先後獲批用於治療攜帶dMMR的癌症患者。

儘管PD-L1和dMMR的檢測都獲得了FDA的批准，實際上它們都有自身的不足。

以PD-L1免疫組化作為生物標誌物存在一些缺陷[23]：採用細針穿刺活檢等獲得的小活檢樣本可能漏檢某些腫瘤；患者個體的PD-L1表達水平可隨時間的推移或解剖部位的不同而發生改變；既往治療可能改變PD-L1的表達；某些抗體檢測PD-L1表位可能不穩定；用於檢測PD-L1的抗體具有不同的親和力和特異性；PD-L1可表達於腫瘤微環境內的多種細胞類型。

各種檢測方法判定的PD-L1水平不一致率高達50%[24]。此外，有研究表明，PD-1/PD-L1檢測的假陽性高達42%，假陰性高達28%[25]。

對於dMMR而言，我們可以看看它在各種不同的癌種中的攜帶比例[26]。

顯然，我們還需要其他更有代表性的標誌物。其實，從免疫治療開始進入臨床階段的時候，科學家就在尋找。

TMB的誕生

有賴於基因測序技術的進步，紀念斯隆-凱特琳癌症中心（MSKCC）的Jedd D. Wolchok和Timothy A. Chan領導的研究團隊，嘗試從腫瘤基因組學的角度回顧性地探索這一重要問題。

既然免疫治療是否有抗癌效果，主要依賴於免疫細胞對癌細胞特異性抗原的識別；那麼，從理論上講，那些攜帶基因突變越多的癌症患者，癌細胞產生的新抗原越多，被免疫細胞識別的可能性更高。也就是說，腫瘤組織的突變負荷（tumor mutational burden，TMB）越高，患者或許從免疫治療中獲益越多。

2014年，通過分析接受過CTLA-4抗體治療癌症患者的全外顯子（WES）測序數據，研究人員研究了TMB與治療效果之間的關係[27]。

很幸運，他們發現了TMB與免疫治療效果之間的關係，但是遺憾的是單獨依賴腫瘤突變負荷，不足以預測患者的預後。這個研究也證實了，一直以來被認為對癌症的發展方向沒左右能力的「乘客突變」，極有可能是腫瘤是否響應免疫治療的「免疫決定因素」這一假說。也為用外顯子測序指導免疫治療提供了理論依據。這也是TMB首次邂逅免疫治療。

伴隨著2014年下半年，兩款PD-1抗體分別獲得FDA的上市批准。Timothy A. Chan又帶領研究團隊分析了腫瘤突變與PD-1抗體治療響應之間的關係。

不出意外，在兩個隊列的回顧性研究中，再次藉助全外顯子測序（WES），Timothy A. Chan發現，在接受PD-1抗體治療的非小細胞肺癌患者中，腫瘤中較高的非同義突變負擔與客觀反應提升，持久的臨床益處和無進展存活相關。2015年初，這項臨床回顧性研究結果發表在《科學》上[28]。

在TMB走向巔峰的過程中，最讓人震驚的事件發生在前兩年。

2016年，施貴寶（BMS）宣布其PD-1抗體nivolumab在非小細胞肺癌III期臨床Checkmate-026中沒有抵達主要臨床終點[29]。對於那些PD-L1≥5%，且未經治療的晚期肺癌患者，nivolumab未能比標準化療延長無進展生存期。

按照之前對免疫檢查點抑製劑的理解，PD-L1≥5%療效還不好，這是難以置信的。不過它發生了，事實就擺在那裡。研究人員認為，Checkmate-026失敗的鍋，不能讓nivolumab背，背後肯定有其他原因。

於是他們又回過頭去分析試驗數據，發現TMB水平高的患者，用nivolumab進行治療後，腫瘤緩解和生存獲益的結果都顯著優於化療[30]。

TMB這才吸引了全世界的目光。

上面的兩個回顧性研究表明，TMB可能是預測免疫治療效果的優秀標誌物。不過，如果是用全外顯子測序評估腫瘤組織的TMB，這個成本恐怕會高的沒人用的起。所以，這兩個研究也沒有引起太大的轟動效應。

Foundation Medicine, Inc（FMI）和MSKCC的努力讓事情出現了轉機。

其中FMI推出了FoundationOne（F1），這款產品分析數百個癌症相關基因的總計約1.1Mb大小的外顯子序列，然後計算TMB水平。

大量的研究表明，以F1為代表的TMB檢測與WES相比，一致性高[31-33]。

2017年，FMI發布了接受F1檢測的10萬例患者數據分析[34]。數據顯示，通過F1評估的TMB與全外顯子（WES）測序一樣準確。

此外，這個研究還全面評估了百餘種癌症的TMB圖譜，分析了TMB與MSI之間的關係。他們發現，83%的MSI-H同時也是TMB-H，且97%的MSI-H樣本的TMB≥10 mut/Mb；只有16%的TMB-H樣本同時為MSI-H。這也意味著，TMB可能比dMMR和MSI使用範圍更廣。

同年，約翰·霍普金斯大學的Elizabeth Marion Jaffee教授在分析了多個臨床研究數據之後，得出結論[35]：TMB對27種腫瘤類型的免疫治療有顯著的預測作?，TMB與ORR之間存在顯著相關性（P＜0.001），相關係數為0.74，這意味著在這27種腫瘤中，55%的ORR差異可以用TMB來解釋；凸顯了TMB與抗PD-1治療療效之間存在強相關性。

基於前期的一系列高質量研究，FDA最終批准了FoundationOne CDx成為首個泛瘤種伴隨診斷產品，它覆蓋了324個基因，兩個預測免疫檢查點抑製劑療效的分子標記MSI和TMB（TMB計算方法：0.8Mb編碼區域里包含所有的同義突變和非同義突變，並去掉胚系突變和腫瘤驅動突變），覆蓋全部實體瘤（除肉瘤）。

FDA批准FoundationOne CDx上市

到了2018年，證明TMB實力的前瞻性研究論文終於發表。

這項在非小細胞肺癌中開展的的臨床研究（CheckMate-227），使用了FMI的伴隨診斷產品FoundationOne CDx。結果表明：在TMB≥10 mut/Mb的晚期非小細胞肺癌患者中，與鉑類雙聯化療相比，nivolumab加低劑量ipilimumab治療明顯延長了1年的無進展生存率（42.6% vs 13.2%），翻了3倍多；無進展生存期也顯著延長（7.2月 vs 5.4月）[36]。

在剛剛閉幕的2018年歐洲腫瘤醫學協會會議（ESMO）上，FMI的科學家又系統地分析了FoundationOne CDx計算的TMB與全外顯子檢測的匹配度。研究人員再次證實，只要臨床組織樣本中腫瘤細胞的含量能達到20%，FoundationOne CDx計算的TMB就能達到非常好的可重複性，可重現性，靈敏性和準確性。

這個研究結果是在全球範圍內首次在III期臨床試驗中證實：無論PD-L1表達水平如何，只要非小細胞肺癌患者的TMB高，聯合免疫治療都能夠給他們帶來無進展生存期顯著獲益。也是首個證實TMB可以作為免疫治療效果預測伴隨診斷方法的前瞻性臨床研究。

與此同時，另一項並列開展中的CheckMate568也表明，在接受nivolumab加ipilimumab治療的非小細胞肺癌患者，TMB≥10 mut/Mb的患者中位無進展生存期幾乎是TMB＜10 mut/Mb患者的3倍（7.1月 vs 2.6月），無論PD-L1表達水平如何。

這兩個研究奠定了TMB在預測免疫治療效果中的地位。

正是基於這些研究成果，在今年剛剛推出的非小細胞肺癌NCCN指南中，TMB赫然在列，成為非小細胞肺癌患者接受免疫治療的推薦檢測方法。

儘管如此，TMB仍面臨一些問題。從前面的臨床研究中我們也不難看出，有些TMB非常高的患者對免疫治療也沒有反應，有些TMB低的患者使用免疫檢查點抑製劑效果卻很好。

這意味著，除了TMB之外，患者對免疫治療的響應程度還與其他多種因素有關。這也提示，將TMB與其他的標誌物聯合使用可能會提升TMB的預測能力。

近日，Razvan Cristescu等在《科學》上發表的一項研究成果給了我們一定的啟示：同時檢測T細胞的活性水平和TMB可能是個不錯的方向[37]。

此外，目前TMB檢測主要還是基於腫瘤組織。然而，有很多患者沒有足夠的腫瘤組織可供使用，甚至有些患者還不適合做組織活檢，在非小細胞肺癌裡面就有近30%的患者是這樣的狀況[38，39]。

或許在不久的將來，醫生可以直接從癌症患者身上抽一管血，就可以評估T細胞的活性和癌細胞的免疫原性，最終實現準確的判斷患者對免疫治療的反應。

編輯神叨叨

前面還有很多未知等著科學家和醫生去探索。

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本文作者 | BioTalker

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