2018年11月CRISPR/Cas最新研究進展

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基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短迴文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。

2018年11月26日，中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經過基因編輯的嬰兒---一對雙胞胎女性嬰兒---在11月出生。他利用一種強大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對這對雙胞胎的一個基因進行修改，使得她們出生後就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫艾滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內外網站上迅速發酵，引發千層浪。有部分科學家支持賀建奎的研究，但是更多的是質疑，甚至是譴責。

即將過去的11月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報道的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。

1.CRISPR基因組編輯有望用於整形外科中

doi:10.1097/PRS.0000000000004863

CRISPR基因組編輯技術有望導致基因工程和治療發生「變革性飛躍」，它幾乎影響到醫學的每個領域。根據2018年11月發表在美國整形外科學會（American Society of Plastic Surgeon）官方期刊Plastic and Reconstructive Surgery上的一篇標題為「CRISPR Craft: DNA Editing the Reconstructive Ladder」的論文，所涉及的醫學領域包括整形手術，這種基因組編輯技術有望在從預防顱面畸形到治療性皮膚移植再到新型無排斥移植等方面取得潛在的進展。

美國整形外科學會會員、麻省總醫院外科醫生Eric Chien-Wei Liao博士說，「CRISPR對治療人類疾病的潛在影響包括對整形外科醫生比較重要的幾個領域，比如腫瘤學、傷口癒合、免疫學和顱面畸形。」在這篇關於再生醫學的特稿論文中，Liao博士等人回顧了CRISPR基因組編輯的歷史和機制，強調了它在整形手術（plastic surgery）和重建手術（reconstructive surgery）中的潛在用途和影響。

2.Nature子刊：利用納米磁鐵對體內CRISPR/Cas9基因組編輯進行空間控制

doi:10.1038/s41551-018-0318-7

在一項新的研究中，美國萊斯大學生物工程師Gang Bao及其團隊將磁性納米顆粒與一種從苜蓿環紋夜蛾（Autographa californica, 一種原產於北美洲的蛾類物種）體內獲得的病毒相結合開發出一種運送載體來運送CRISPR/Cas9，從而通過空間控制對特定組織或器官中的基因進行修飾。相關研究結果於2018年11月12日在線發表在Nature Biomedical Engineering期刊上，論文標題為「Spatial control of in vivo CRISPR–Cas9 genome editing via nanomagnets」。

源自這種病毒的圓柱形桿狀病毒載體（baculovirus vector, BV）被認為足夠大，它的直徑高達60nm，長度高達200～300納米。這種大小足夠運送長38000多個鹼基對的DNA。

這些研究人員僅在需要時利用磁性納米顆粒激活這種桿狀病毒載體並運送用於基因編輯的有效載荷。為了做到這一點，他們使用了一種名為C3的免疫系統蛋白，其中，在正常情形下，蛋白C3讓桿狀病毒滅活。施加磁場允許桿狀病毒載體轉導，即一種將有效載荷引入到靶細胞中的過程。這種有效載荷也是DNA，它編碼一種報告基因和CRISPR/Cas9系統。在測試中，桿狀病毒載體攜帶著綠色熒光蛋白或螢火蟲熒光素酶。具有這種蛋白的細胞在顯微鏡下明亮地發光，並且實驗表明在細胞培養物和實驗室動物中，利用磁鐵高效地靶向運送攜帶著有效載荷的桿狀病毒載體。

3.Cell：開發出SLICE工具，鑒定出人T細胞免疫功能的關鍵調節基因

doi:10.1016/j.cell.2018.10.024

在一項新的研究中，來自美國加州大學舊金山分校的研究人員設計出一種基於CRISPR的稱為SLICE（single guide RNA lentiviral infection with Cas9 protein electroporation, 即利用Cas9蛋白電穿孔進行單嚮導RNA慢病毒感染）的系統，這種系統將使得科學家們能夠快速評估直接從患者體內提取出的「原代」免疫細胞中每個基因的功能。這種新方法為科學家們提供了一個強大的工具，能夠在確定如何最好地改造免疫細胞來對抗癌症和一系列其他疾病時指導他們作出決策。相關研究結果於2018年11月15日在線發表在Cell期刊上，論文標題為「Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function」。論文通訊作者為加州大學舊金山分校微生物學與免疫學副教授Alexander Marson博士。論文第一作者為加州大學舊金山分校的Eric Shifrut 和Julia Carnevale。

圖片來自Cell, doi:10.1016/j.cell.2018.10.024。

作為一種概念驗證，這些研究人員測試了他們是否能夠利用SLICE鑒定出讓T細胞---一種常見的免疫細胞類型---更有效地增殖的基因。這對於癌症免疫療法尤為重要，這是因為癌症免疫療法利用人工刺激的經過基因改造的T細胞來殺死癌症。到目前為止，這些療法僅對某些惡性腫瘤有效，不過科學家們認為，鑒定出促進T細胞增殖的基因能夠讓癌症免疫療法適用於更多的患者。

利用SLICE，這些研究人員能夠鑒定出促進T細胞增殖的基因，以及抑制這種增殖的基因。雖然其中的一些基因之前已利用其他的發現方法進行了描述，但是許多基因都是全新的，這表明SLICE能夠揭示其他方法未能捕獲的關鍵性的增殖調節因子。

在鑒定出這些基因後，這些研究人員從多個人類供者中獲得原代T細胞，並剔除了經發現抑制T細胞增殖的基因。當這些經過CRISPR修飾的T細胞在癌症存在下進行培養時，它們顯示出顯著改善的癌症殺傷能力，這表明科學家們能夠對利用SLICE鑒定出的基因進行編輯，從而將普通的T細胞轉化為一種潛在的強效療法。

4.Nature：精確編輯基因有戲！利用機器學習演算法準確地預測細胞如何修復CRISPR誘發的DNA斷裂

doi:10.1038/s41586-018-0686-x

當雙螺旋DNA因損傷（比如X射線暴露）發生斷裂時，細胞中的分子機器會開展基因「自動校正（auto-correction）」，從而將基因組重新連接在一起，但是這種修復通常是不完美的。細胞中的天然DNA修復過程能夠以一種看似隨機且不可預測的方式在斷裂位點處添加或移除DNA片段。利用CRISPR-Cas9編輯基因能夠在特定位點上讓DNA發生斷裂，但是這可能會產生「拼寫錯誤（spelling error）」，從而改變基因的功能。這種對CRISPR誘導的損傷作出的反應稱為「末端連接（end joining）」，對讓基因失去功能是非常有用的，但是科學家們認為它太容易出錯而不能夠用於治療目的。

不過一項新的研究推翻了這個觀點。通過構建出一種預測人類細胞和小鼠細胞如何對CRISPR誘導的DNA斷裂作出反應的機器學習演算法，來自美國麻省理工學院、麻省總醫院、哈佛大學、布萊根婦女醫院和布羅德研究所的研究人員發現細胞經常以精確和可預測的方式修復斷裂的基因，有時甚至讓突變基因返回到它們的健康版本。此外，他們將這種預測能力用於測試，並成功地校正了從患有兩種罕見遺傳疾病之一的患者體內獲取的細胞中的基因突變。這項研究表明細胞的基因自我校正能力有朝一日可能與基於CRISPR的療法聯合使用，通過精確地切割DNA和允許細胞天然地修復損傷來校正基因突變。相關研究結果於2018年11月7日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants」。論文通信作者為布羅德研究所副所長David Liu教授、麻省理工學院計算機科學與生物工程教授David Gifford和布萊根婦女醫院醫學助理教授Richard Sherwood。

在這項新的研究中，這些研究人員開發出一種策略來觀察細胞如何修復小鼠和人類基因組中CRISPR靶向切割的2000個位點。在觀察到細胞如何修復這些切割之後，他們將所獲得的數據輸入到一種稱為inDelphi的機器學習模型中，從而促進這種演算法學習細胞如何對每個位點上的切割作出反應，也就是細胞將哪些DNA片段添加到每個受損基因上，或者從每個受損基因中移除哪些DNA片段。

他們發現inDelphi能夠識別出切割位點上的模式，這些模式可預測在經過校正的基因中發生了哪些DNA片段插入和缺失。在很多位點上，經過校正的基因並不包含大量的變異，而是一種單一的結果，如校正致病性的基因。

事實上，在利用inDelphi查詢通過切割恰當的位點能夠校正的疾病相關基因後，這些研究人員發現了將近200種致病性的基因變異體，這些變異體在通過CRISPR相關酶切割後大部分被校正為正常的健康形式。他們也能夠校正來自患有兩種罕見遺傳疾病---赫曼斯基-普德拉克綜合征（Hermansky-Pudlak syndrome）和門克斯病（Menkes disease）---的患者的細胞中的基因突變。

5.Circ Res：重大進展！利用CRISPR/Cas9基因組編輯有望阻止心源性猝死

doi:10.1161/CIRCRESAHA.118.313369

在一項新的研究中，美國貝勒醫學院的Xander Wehrens博士及其同事們研究了心臟病，包括遺傳性心律失常。除了經常與心源性猝死的高發病率相關之外，這些疾病是很難治療的。相關研究結果近期發表在Circulation Research期刊上，論文標題為「In Vivo Ryr 2 Editing Corrects Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia」。

圖片來自Circulation Research, doi:10.1161/CIRCRESAHA.118.313369。

Wehrens說，「對這項特殊的研究而言，我們的靈感來自一名患上一種稱為兒茶酚胺性多形性室性心動過速（catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, CPVT）的遺傳性心律失常的年輕患者。我們的這名患者有反覆發作的心律失常---心跳過快或不規則---以及昏厥發作。這名患者的幾名家庭成員已將近出現致命性的心律失常或心源性猝死。當前的治療選擇包括抗心律失常藥物和植入式除顫器---一種校正某些不規則心跳的裝置---對這名患者來說並不是最佳選擇。」

遺傳學研究已表明年輕患者心律失常的原因是基因RYR2發生突變。這種基因發生的突變占將近60%的CPVT病例。這種基因編碼的蛋白形成一種調節心肌細胞中鈣離子流動的通道。心肌細胞需要適當的鈣離子流動，從而能夠以一種協調的方式進行收縮和舒張。

Wehrens和Lagor設計了AAV載體，將CRISPR/Cas9（AAV-CRISPR）運送到活體動物的心臟中。他們推斷清除RYR2基因的致病性拷貝（攜帶著R176Q突變），能夠校正小鼠所患的這種致命性的心律失常。為了測試這種新方法，AAV-CRISPR被用來選擇性地破壞R176Q CPVT小鼠模型中的RYR2突變基因。在出生10天後，攜帶R176Q突變的小鼠和正常小鼠接受單次注射AAV-CRISPR或安慰劑治療。五到六周後，這些研究人員對這些小鼠進行了評估，結果非常令人鼓舞。攜帶致病性R176Q突變且接受AAV-CRISPR治療的小鼠均未發生心律失常。相比之下，71%的攜帶著這種突變且接受安慰劑治療的小鼠確實發生了心律失常。利用AAV-CRISPR對RYR2基因的缺陷性拷貝進行編輯會極大地降低存在功能障礙的RYR2蛋白的丰度。此外，仍然存在的RYR2基因的單個健康拷貝足以支持適當的心臟功能。在正常或攜帶這種突變的小鼠組中未觀察到與治療相關的不良事件。

6.Nat Med：人類機體真的對CRISPR-Cas9基因編輯工具存在免疫力嗎？

doi:10.1038/s41591-018-0204-6

如今CRISPR-Cas9基因編輯系統在基因治療領域產生了激動人心的成果，這就激發了科學家們利用該工具治療人類遺傳性疾病的新希望，近日，一項刊登在國際雜誌Nature Medicine上的研究報告中，來自德國的科學家們通過研究人類機體對CRISPR-Cas9的免疫反應，結果發現，人類機體能對Cas9蛋白產生較為廣泛的免疫力，如今研究人員正在開發多種創新性策略來確保CRISPR-Cas9基因編輯系統能在一系列臨床應用中安全使用。

目前並沒有足夠的證據來評估該技術在人類機體中使用所帶來的潛在風險和益處，通過研究人類機體對CRISPR-Cas9系統的免疫反應，研究人員或許就能成功填補這一研究領域的空白；研究者Schmuck-Henneresse說道，Cas9蛋白來源於鏈球菌屬，其組成了CRISPR-Cas9系統的關鍵部分，鏈球菌的感染在人類機體中非常常見，因此研究人員推測，是否人類機體會對Cas9蛋白預先存在免疫記憶。

研究者在幾乎所有的健康人類受試對象中都能發現其機體中T細胞會對Cas蛋白產生反應，Cas分子源於其它細菌，比如鏈球菌和胃腸道細菌等，其能夠產生特殊類型的免疫反應，這一現象的產生或是由於酶類之間相似性較高所致；在基因療法治療期間，這些免疫細胞能夠產生一些不好的免疫反應，從而潛在影響CRISPR-Cas9基因編輯技術的安全性和有效性，當然了，CRISPR-Cas9技術或許也存在一定風險，這是研究人員需要提前想好的。

研究者表示，這意味著在體內被遺傳修飾的細胞並不應該被輸入到CRISPR-Cas9系統依然保持活性的患者機體中，如今研究者開發了一種檢測技術來確保細胞產物能夠被安全使用，其能夠可靠地確定患者機體的免疫反應風險是否處於較低的水平；然而，某些遺傳性疾病會產生一些組織缺陷，這些缺陷在人類體外都無法被修飾，因此研究人員就需要尋找新型的解決手段來抑制機體對CRISPR-Cas9基因編輯工具所產生的危險免疫反應。

7.Methods Mol Biol：利用CRISPR/Cas9構建視網膜變性模型

doi:10.1007/978-1-4939-8669-9_14

加拿大哥倫比亞大學眼科學與視覺科學系的Feehan JM等人近日在Methods Mol Biol雜誌上發表了一篇文章，他們利用CRISPR / Cas9基因編輯技術構建了視網膜變性的動物模型。

之前的研究已證明非洲爪蟾（Xenopus laevis）是可以用於快速構建和分析人視網膜疾病轉基因模型的有效系統。然而，該系統缺乏穩健的基因插入和敲除的試驗技術，因此受到一定的限制。在這裡，他們通過使用Cas9基因編輯技術，構建了X.laevis胚胎，並對這個方案進行了詳細的描述。

他們使用該技術將點突變引入X.laevis的基因組中，使閱讀框內和框外產生插入和缺失。構建的動物模型允許對人類顯性和隱性遺傳疾病進行建模，並可以有效地產生基因敲低和敲除的效果。

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