Science∣湯富酬研究組與合作者揭示人類結直腸癌發病新機制

2018年11月30日，北京大學生命科學學院生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創新中心（ICG）湯富酬研究組，與北醫三院付衛研究組、喬傑研究組，在《Science》期刊發表了題為「Single-cell Multi-omics Sequencing and Analyses of Human Colorectal Cancer」的研究論文。該研究在國際上首次從單細胞解析度、多組學水平深入解析了人類結直腸癌在發生和轉移過程中，基因組拷貝數變異、DNA甲基化異常及基因表達改變的特點及相互關係。

結直腸癌是發病率和死亡率很高的一種癌症。基因組不穩定性、表觀遺傳學異常及基因表達紊亂等是結直腸癌典型的分子特徵。腫瘤組織具有很強的異質性，以往在大量細胞水平的研究只能反映腫瘤組織的系綜平均情況，而無法精準區分不同的腫瘤亞克隆以及腫瘤微環境中的其他細胞類型。一般的單細胞單組學測序技術只能分別研究單細胞基因組、單細胞DNA甲基化組、或者單細胞轉錄組，不能做到在一個單細胞中同時平行分析多個組學層面。湯富酬研究組對該課題組已發表的scTrio-seq（single-cell triple omics sequencing technique）技術進行了大幅度的優化，極大地提升了對單個細胞轉錄組的檢測效率和DNA甲基化位點（CpG位點）的覆蓋度，達到與利用完整單細胞進行高精度轉錄組分析、或者利用完整單細胞進行高精度DNA甲基化組分析相近的效果。在HEp-2細胞系中，單個完整細胞的高精度轉錄組測序平均可以檢測到9,158個基因的表達，而scTrio-seq2的轉錄組部分平均可以檢測到8,106（88%）個基因的表達；DNA甲基化組方面，scTrio-seq2的DNA甲基化組部分和單個完整細胞的高精度DNA甲基化組測序（scBS-seq）均可以檢測到1600多萬個CpG位點。該研究對患有結直腸癌並伴隨轉移的12例患者的原發位、淋巴結轉移位、肝轉移位等樣品進行了多點取樣，對1,800多個細胞進行了高精度的單細胞多組學測序（scTrio-seq2），共產生了7.6 Tb高質量的測序數據。scTrio-seq2的DNA甲基化組部分，平均每個細胞的測序量為4.1 Gb，平均覆蓋到全基因組範圍的870多萬個CpG位點；scTrio-seq2的轉錄組部分，平均每個細胞測序量為0.9 Gb，平均可覆蓋到3700多個基因。

圖1. 課題研究思路及多點取樣示意圖

該研究的主要發現有：

1、基於DNA甲基化組數據推斷出的基因組拷貝數變異精準鑒定了腫瘤細胞的亞克隆。該研究精準鑒定出了結直腸癌患者單個癌細胞的染色體拷貝數變異譜，並利用其高精度的染色體內斷點信息進行了腫瘤細胞的譜系追蹤。對於其中5例患者，在每個患者腫瘤組織中鑒定出了多個（6-13個）腫瘤細胞亞克隆，發現原發位腫瘤的亞克隆結構通常比轉移位腫瘤更複雜。

圖2. CRC01患者癌細胞的單細胞染色體拷貝數變異譜

圖3. CRC01患者癌細胞的單細胞染色體拷貝數變異的斷點

圖4. CRC01患者的腫瘤亞克隆結構示意圖

2、系統解析了腫瘤細胞的DNA甲基化異質性。在全基因組水平，檢測到腫瘤細胞的DNA甲基化水平普遍低於癌旁的正常上皮細胞，而且DNA甲基化降低的程度存在很大的異質性。與癌旁的正常上皮細胞相比，單個腫瘤細胞全基因組DNA甲基化水平可降低7-36%。腫瘤細胞特異性DNA低甲基化基因組區域顯著富集在LTR、LINE等基因組重複序列和異染色質區域，而腫瘤細胞特異性DNA高甲基化的基因組區域顯著富集在CpG島和常染色質區域。

圖5. 不同結直腸癌患者及取樣部位的單細胞DNA甲基化水平

03、闡明了DNA甲基化譜和遺傳譜系的相互關係。利用鑒定出的腫瘤細胞遺傳譜系信息，發現腫瘤細胞的基因組DNA甲基化譜與遺傳譜系高度一致，同一塊腫瘤組織中同一譜系的腫瘤細胞DNA甲基化水平高度相似，而不同譜系的腫瘤細胞DNA甲基化水平可存在很大差異。所以腫瘤組織基因組DNA甲基化的強烈異質性主要來自同一個患者腫瘤內不同亞克隆之間的DNA甲基化差異，而不是同一個亞克隆內部不同細胞間的DNA甲基化差異。

圖6. CRC01患者不同遺傳譜系的癌細胞的單細胞DNA甲基化水平

04、闡釋了DNA甲基化譜和基因表達譜的相互關係。在單細胞水平，基因啟動子區域的DNA甲基化與相應基因的表達呈現強烈的負相關關係，而基因區的DNA甲基化與相應基因的表達呈現正相關關係。對於測序單細胞數量較多的4例結直腸癌患者，其中1例患者腫瘤細胞的轉錄組亞群、遺傳亞群（亞克隆）、和DNA甲基化亞群三者之間呈現出一一對應關係；而在另外3例患者中，轉錄組亞群、遺傳亞群（亞克隆）、以及DNA甲基化亞群三者之間的關係較為複雜，沒有簡單的一一對應關係。

圖7. 腫瘤細胞的遺傳譜系、DNA甲基化、基因表達三者之間單細胞解析度的對應關係

05、首次在單細胞解析度追蹤了同一遺傳譜系的腫瘤細胞在轉移過程中DNA甲基化及基因表達的變化情況。對於同一個癌症患者同一遺傳譜系的腫瘤細胞在從原發灶到轉移灶的轉移過程中其全基因組DNA甲基化水平相對穩定，而基因組局部區域的DNA甲基化水平可能發生較大變化。上皮-間充質轉化相關的重要基因在轉移前後的腫瘤細胞中其RNA表達水平和DNA甲基化水平均沒有發生顯著改變。

圖8. 同一遺傳譜系的腫瘤細胞在轉移過程中的單細胞解析度的DNA甲基化水平變化

06、揭示了結直腸癌細胞DNA去甲基化的共同特點。在全部進行了單細胞基因組DNA甲基化測序的10個患者中，腫瘤細胞的DNA去甲基化程度與相應基因組區域在癌旁正常上皮細胞中的DNA甲基化水平呈現正相關關係，也就是說，在正常上皮細胞中DNA甲基化越高的基因組區域，其DNA去甲基化越強烈（DNA甲基化降低的絕對值和降低的相對比例都更大）。DNA去甲基化的程度與基因組重複序列L1以及癌旁正常組織中H3K9me3標記的異染色質區域的分布密度呈現強烈的正相關關係，而與開放的染色質區域以及H3K4me3標記的基因組區域呈現強烈的負相關關係。與正常的早期胚胎髮育過程中的兩次大規模基因組DNA去甲基化相反，相比於L2基因組重複序列，進化上更為年輕、更為活躍的L1基因組重複序列經歷了更強烈的DNA去甲基化。

圖9. CRC01患者癌細胞相比於癌旁細胞的DNA甲基化水平

07、揭示了結直腸癌細胞染色體水平的DNA甲基化異常和基因組不穩定性的特點。在結直腸癌細胞中，相比於其他17條染色體，有6條染色體（4號、5號、8號、13號、18號、和X染色體）傾向於發生更強烈的DNA去甲基化。其中8號、13號、和18號染色體在TCGA資料庫（178個非高頻點突變類型的病例樣本）以及該研究的12個病例中均同時具有高頻的拷貝數變異。在這6條基因組DNA去甲基化更強烈的染色體中，有5條染色體（4號、5號、8號、13號、和X染色體）也同時顯著富集基因點突變（單核苷酸變異）。

圖10. 結直腸癌細胞染色體水平的DNA甲基化異常和基因組不穩定性的特點

綜上所述，通過對10例結直腸癌患者的高精度單細胞多組學測序分析和深度數據挖掘，該研究揭示了結直腸癌腫瘤發生和轉移過程中基因組DNA甲基化變化的關鍵特徵，提示在腫瘤發生過程中大規模的DNA去甲基化很可能是早期事件，並在後續腫瘤轉移過程中保持相對不變，說明相對穩定的全基因組DNA低甲基化是結直腸癌每個腫瘤細胞的基本特徵。而同一個患者的同一個亞克隆的腫瘤細胞其轉錄組可以仍然有強烈的異質性，並且同一個患者的不同亞克隆的腫瘤細胞可以有相同的轉錄組亞群，說明腫瘤細胞的轉錄組特徵中很大一部分是對腫瘤微環境的動態響應而不完全是由其遺傳譜系決定的。該研究既發現了結直腸癌細胞基因組DNA甲基化層面強烈的患者個體間差異以及個體內的腫瘤細胞異質性等個性特徵，同時也發現了不同患者個體之間、不同腫瘤部位之間腫瘤細胞DNA甲基化改變的共性規律，對於基於干預DNA甲基化的腫瘤治療方案給出了新的啟示。

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