Nature丨于洋博士等發現基因組長片段DNA插入的新機制

（圖片引自：https://www.bcm.edu/news/genetics/without-dna2-genes-jump-into-dna-breaks

用釣魚來比喻染色體上斷裂的雙鏈DNA能夠捕獲遊離的長片段DNA。）

本文轉載自「BioArt」。

我們身體中每個細胞的基因組DNA每天都會面臨成千上萬次的損傷。所幸的是，細胞中有一套能夠修復各種類型損傷的機器來保證基因組的完整性（genome integrity）。修復DNA損傷的機器在從酵母到人所有的真核生物中都是非常保守的，因此酵母作為模式生物被廣泛應用於DNA修復（DNA repair）方面的研究。在所有類型的DNA損傷中，DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）是最嚴重的。DNA雙鏈斷裂如果得不到正確的修復往往會引發癌症。對DNA雙鏈斷裂修復機制進行研究不僅關係到人類健康，還有助於對一些基本的生物學問題如基因組的突變、重組和進化的理解。DNA雙鏈斷裂主要通過兩種途徑進行修復：同源重組（homologous recombination, HR）和非同源末端連接（nonhomologous end-joining, NHEJ）。同源重組依賴於完整的同源序列進行修復，因此保真性高。而非同源末端連接不依賴於模板，保真性差，修復產物通常帶有幾個鹼基對的插入或缺失。

之前，人們檢測非同源末端連接的修復產物，偶爾會看到一些長片段DNA序列——來自可移動的遺傳元件如轉座子、細胞核基因組其他區域以及線粒體DNA——會插入到DNA雙鏈斷裂部位從而影響基因組的完整性。長片段DNA的插入在癌症基因組裡普遍存在【1】。有意思的是，最近在產生抗體的B淋巴細胞中V（D）J位點也發現了來自基因組其他位點的長片段DNA插入。插入長片段DNA的B淋巴細胞產生的抗體能夠特異性結合瘧原蟲抗原。因此，這種長片段DNA的插入增加了抗體的多樣性【2】。另外，最近在CRISPR/Cas9的基因編輯產物中也發現有長片段DNA插入。但是，人們對於長片段DNA插入的機理還不明確。這種長片段DNA在細胞里是如何產生的？細胞又是如何抑制長片段DNA插入的呢？

近日，來自美國貝勒醫學院的Grzegorz Ira實驗室、休斯頓衛理公會醫院Kaifu Chen實驗室和安德森癌症中心的Guang Peng博士等（第一作者為于洋博士，2013年畢業於北京生命科學研究所杜立林實驗室，另外兩名並列第一作者是Nhung Pham和Bo Xia，共同通訊作者為Grzegorz Ira博士和Kaifu Chen博士）在Nature雜誌上發表了題為Dna2 Nuclease Deficiency Results in Large and Complex DNA Insertions at Chromosomal Breaks的研究論文，報導了酵母核酸酶Dna2缺失突變體中DNA雙鏈斷裂部位具有高頻率的長片段DNA序列插入。這是目前為止報導的第一個有這樣表型的真核生物突變體。

Dna2的缺失突變體中，插入到DNA雙鏈斷裂部位的長片段DNA序列長度大約100-1500 bp。大部分插入都只有一個供體片段，另外一些是2-4個來自於基因組不同位點的供體片段連在一起進行插入。通過分析這些插入序列，發現供體DNA來自於逆轉座子、核糖體DNA以及整個基因組的其他區域。這些供體DNA顯著地在基因組脆性位點聚集（如複製起點、R-loop、中心粒、端粒以及複製叉受阻區域）。DNA雙鏈斷裂部位長片段DNA插入主要通過非同源末端連接而不是通過同源重組介導。

作者還發現，在Dna2的缺失突變體中，插入序列的供體DNA並沒有從原來位點上刪除，表明這種插入是一種複製-粘貼形式的重複（duplication），造成整個基因組的任何DNA片段都變得可以移動。因為是重複並且供體DNA在脆性位點聚集，提示供體DNA源自過度複製（over-replication）。核酸酶Dna2通過兩種方式抑制DNA的過度複製：第一種方式是在滯後鏈合成過程中，去除岡崎片段上5』端的flap單鏈DNA；第二種方式是阻止複製叉的倒轉（replication fork reversal）和/或降解已經倒轉的複製叉【3-6】。5』端的flap單鏈長DNA可能是供體DNA的一個來源，因為敲除Pif1和Pol32這兩個複製過程中起取代合成（displacement synthesis）作用的蛋白質能夠減低長片段DNA插入頻率並且降低了供體DNA的長度。

由於供體DNA在複製叉前行容易受阻的脆性位點聚集，表明倒轉的複製叉也可能是供體DNA的來源。在Dna2缺失情況下，原本通過Dna2加工處理的DNA結構可以通過其他的替代性核酸酶進行加工處理從而從複製叉上脫落。Mus81和Yen1是兩個這樣的結構特異性核酸酶。在Dna2突變體中再引入Mus81和Yen1的突變能夠改變長片段DNA插入頻率。

作者提出一個模型來解釋Dna2缺失突變體中在DNA雙鏈斷裂部位長片段DNA插入：5』端的flap單鏈長DNA和倒轉的複製叉可以通過取代合成以及替代性核酸酶處理後從複製叉上脫離從而遊離於染色體之外；這些遊離的單鏈DNA和雙鏈DNA可以被雙鏈斷裂的DNA末端捕獲從而作為底物通過非同源末端連接修復途徑被插入到斷裂部位（下圖）。與這個模型相符的是，作者發現相比野生型而言，Dna2缺失突變體具有更多遊離的長片段DNA。並且發現外源導入的單鏈DNA和雙鏈DNA不僅在Dna2缺失突變體中而且也可以在野生型細胞中被插入到DNA雙鏈斷裂部位，表明只要長片段單鏈DNA或雙鏈DNA存在於細胞中就可以被斷裂的DNA雙鏈末端捕獲而不必需要缺失Dna2。

Dna2缺失的細胞中大片段插入的模型

這項研究中發現的抑制基因組不穩定性（genome instability）的新機製為癌症基因組和V（D）J位點中類似大小的長片段DNA插入提供了一個可能的解釋。遊離於染色體外的長片段DNA被斷裂的DNA雙鏈末端捕獲會對基因組的完整性形成威脅，但是也可能在進化過程中能夠促進基因和其他遺傳元件的重複以及物種間的基因水平轉移。長片段DNA插入有可能促進腫瘤的發生，因此抑制遊離的長片段DNA的產生或者促進它們的降解可能是一個潛在的防治腫瘤的方案。

參考文獻

1. Li, Y. et al. Patterns of structural variation in human cancer. BioRxiv doi: https://doi.org/10.1101/181339 (2017).

2. Pieper, K. et al. Public antibodies to malaria antigens generated by two LAIR1 insertion modalities. Nature 548, 597-601, doi:10.1038/nature23670 (2017).

3. Budd, M. E., Reis, C. C., Smith, S., Myung, K. & Campbell, J. L. Evidence suggesting that Pif1 helicase functions in DNA replication with the Dna2 helicase/nuclease and DNA polymerase delta. Mol Cell Biol 26, 2490-2500 (2006).

4. Hu, J. et al. The intra-S phase checkpoint targets Dna2 to prevent stalled replication forks from reversing. Cell 149, 1221-1232, doi:10.1016/j.cell.2012.04.030 (2012).

5. Thangavel, S. et al. DNA2 drives processing and restart of reversed replication forks in human cells. J Cell Biol 208, 545-562, doi:10.1083/jcb.201406100 (2015).

6. Liu, B., Hu, J., Wang, J. & Kong, D. Direct Visualization of RNA-DNA Primer Removal from Okazaki Fragments Provides Support for Flap Cleavage and Exonucleolytic Pathways in Eukaryotic Cells. J Biol Chem 292, 4777-4788, doi:10.1074/jbc.M116.758599 (2017).

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