盤點轉錄組測序問題Top10

2018年已接近尾聲，估計小夥伴們正忙於總結工作，整理實驗數據。小編正好在總結2018年轉錄組測序常見的問題，希望對各位小夥伴有所幫助。

01

生物學重複設置幾個合適？生物學重複取樣有什麼要求？

1）推薦生物學重複≥3，有文章表明生物學差異是基因自身表達的特性，與檢測技術的選擇以及數據處理的方式無關。如果不設生物學重複，高影響因子的雜誌可能會因此而拒稿。

註：3個生物學重複，不等同於將3個樣品的RNA等量混合後測序。3個樣品等量混合測序，相當於將3個樣本的基因表達量取了平均值，其實就是相當於取了一個樣本，不能反應群體生物學現象。

2）生物學重複取樣要求：

植物取樣：同一片試驗田，同一長勢，外部形態特徵相同；

動物取樣：同一遺傳背景，同一飼養條件，同一年齡，性別相同，外部形態特徵相同；

混合取樣：保證混合樣品處理方式相同，處於同一發育階段，個體外部形態特徵相同。

註：混合取樣是針對一個小苗個體抽提的RNA無法達到送樣要求，而混合多個個體抽提RNA具體建議如下：2-3個單株混在一起當作一個樣品，再取另外與前面所取的單株生長差異不大的2-3個單株混在一起當作前一個樣品的生物學重複。

02

樣本檢測時需要達到什麼要求才認為樣本合格？

樣本檢測主要關注的指標為總量、RIN值、OD260/280以及28S/18S（原核生物為23S/16S）。其中RIN值及28S/18S是評估RNA完整性的主要指標，RIN值越高，28S/18S越接近2表明完整性越好。但對於一些特殊樣品，比如某些昆蟲和水產動物，沒有28S條帶，就不能參考RIN值，一般只要18S前基線平穩可認為樣品合格。

03

普通轉錄文庫與鏈特異性文庫的區別？

鏈特異性文庫是在cDNA二鏈合成時用dUTP代替dTTP，PCR前採用UNG酶消化掉含dUTP的DNA單鏈，與Flow cell結合時只保留單一鏈模板，具體流程見下圖：

鏈特異性文庫保留鏈的方向性，區分reads是來自於哪條鏈，減少比對錯誤，使得基因表達定量更精確、可變剪切檢測更準確、非編碼轉錄本的檢出率增高和新轉錄本預測更真實等等。

04

測序數據質控指標有哪些？

1）Clean reads佔Raw reads的比例情況：

Clean Reads即高質量可用reads，Clean reads比例=Raw reads-低質量reads-含N reads-接頭污染reads

2） 測序鹼基分布有無AT、GC分離現象：

根據鹼基互補原則，A和T的比例應該接近，C和G的比例也應該接近

3）reads比對比例情況：

理論上，來自成熟mRNA的reads，應該比對到外顯子區（Exon），但是存在一些原因導致一部分reads比對到內含子區（Intron）和基因間區（Intergentic）；如果參考基因組與測序樣品品種存在差異，則也會導致比對到外顯子區的reads偏少

4） 質量值大於30(Q30)的鹼基在clean data中的佔比情況

5） 測序數據在全基因組覆蓋範圍是否均一

6） 表達水平的飽和曲線：

表達水平的飽和曲線圖是為了檢查測序數據量是否滿足基因定量要求。

05

差異基因數據多少比較合理？

不同處理，不同研究目的，差異基因數目是不同的，從幾十個到幾千個都有可能。但是如果差異基因數目是個位數或者上萬個時，需要和生信分析人員溝通確實是否有問題。

06

為什麼某基因在兩個樣本中表達量差別很大，卻不在差異表達的基因中？

差異表達基因的兩個閾值為|log2Ratio|≥1和q

07

差異基因的GO功能注釋分類統計，是不是找出差異基因個數最多的對應的功能是我們要關注的？

差異個數最多的功能不代表是我們研究的關注點，這些差異個數多的也有可能是一些基礎的功能條目；建議從研究目的著手， 先確定一個方向，比如關注生長相關的基因，可以先研究這部分GO功能，然後再進一步擴展。

08

KEGG 的 pathway 圖中為什麼一個方框裡面同時出現紅色和綠色標記？

方框裡面是一些酶或者是有催化活性的蛋白，而我們知道有些關鍵的酶或重要的蛋白會有多個同源基因編碼，所謂的同工酶；還有一些由多個亞基聚合而成，每個亞基由不同的基因編碼，也就是說這些重要的酶或者蛋白有不同的基因（轉錄本編碼），那麼有時候會出現不同基因表達不一致的情況。

09

如何挑選基因做qPCR驗證？

1）建議驗證實驗具有生物學意義，可以先從GO和KEGG的聚類分析結果入手，篩選研究方向有關的且有差異表達的基因。

2）挑選基因的原則：

a.一般情況下，需要驗證的基因的數目建議不低於20個；

b.樣本間表達差異倍數大（log2(FC)）；

c.基因表達量較高（至少在一個樣品中的表達量高）；

d.基因測序深度read count相對較高等；

e.同時包含上調基因及下調基因；

f.能否設計出好的實時定量引物。

目前，沒有統一固定挑選的標準，需要研究人員根據自己的研究需要進行選擇。

10

qPCR驗證不一致的原因是什麼？

使用qPCR驗證的RNA-Seq定量結果，由於兩種技術本身的差異及表達量計算原理的差異，出現不一致的情況正常。所以建議關注兩種基因表達的檢測結果變化趨勢總體是不是一致，具體表達量的值及差異倍數數據作為參考。如果變化趨勢不一致，可能的原因有以下幾點：

1）要保證測序時所用樣品同qPCR實驗中所用是同一批材料且處理條件一致；

2）盡量選取表達量高的基因進行驗證，同時差異倍數在5~10倍的基因更合適；

3）考慮qPCR實驗的實驗方案、引物序列及原始結果。比如設計探針是否考慮多轉錄本情況，轉錄組測序是對轉錄本。如該基因對應多個轉錄本，則可能有偏差；

4）該基因是否存在新的可變剪切。

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