安諾表觀測序助力卵母細胞甲基化組研究登頂Nature

中國科學院生物物理研究所朱冰研究員課題組首次報道了Stella可通過抑制DNMT1介導的起始性DNA甲基化來控制卵母細胞的甲基化組，研究成果見刊Nature。

安諾基因參與了本研究的高通量測序相關工作，為這一教科書級別研究添磚加瓦。

高等動物的新生命起始於兩性配子結合形成的單細胞合子。個體繼承父母的DNA序列所編碼的生命密碼，同時獲得兩性配子基因組的表觀遺傳修飾特徵，這些特徵對胚胎早期發育具有重要影響。從雌性個體出生到最終形成卵子，卵母細胞會經歷複雜的成長過程，其中伴隨著DNA甲基化水平的逐步增加，而起始性DNA甲基轉移酶（de novo DNA methyltransferase，DNMT）家族在其中起到主要作用[1-2]。不同於大多數細胞在轉錄沉默區域具有較高的DNA甲基化水平，卵母細胞的轉錄沉默區域會呈現低甲基化水平[3-4]，這一特徵的產生機制及其對早期胚胎髮育的影響尚不明了。

考慮到卵母細胞獨特的甲基化模式，在其成長中調控甲基化水平的相關基因也受到廣泛關注。Stella（也被稱為Dppa3或PGC7）是近年來研究熱度頗高的母體效應相關基因之一，在生殖細胞和著床前的胚胎中特異性表達[5-6]。Stella蛋白與UHRF1存在很強的相互作用，而後者會結合DNA並募集DNMT家族的甲基轉移酶。有研究顯示，體細胞中過表達的Stella能抑制UHRF1-DNMT1組成的甲基化酶體系，導致DNA去甲基化水平提高[7]。但Stella及UHRF1、DNMT1在卵母細胞成長以及胚胎早期發育中對基因組甲基化水平的影響如何，一直以來都欠缺完整的研究。

近期，發表於頂尖期刊Nature的一項研究揭示了Stella可以影響UHRF1的細胞內定位並干擾卵母細胞及合子的DNA甲基化情況，第一次提供了DNMT1在體內存在起始性DNA甲基轉移酶活性的證據[8]。這項研究由中國科學院生物物理研究所朱冰研究員課題組主導完成。

考慮到Stella對UHRF1的互作關係，研究者首先利用免疫染色法檢測了卵母細胞中Stella對UHRF1空間定位的影響。Stella在初生雌性小鼠卵母細胞中呈均勻分布，而出生20天後在細胞核相對富集；與此相對，UHRF1在同一時期主要定位於細胞質。突變敲除Stella後，UHRF1在早期聚集在細胞核，出生20天後仍有相當一部分在核內，這表明Stella對UHRF1向細胞質的運輸具有重要影響。研究者之後在細胞中外源表達野生型Stella、與UHRF1親和力低的突變型Stella、出核信號異常的突變型Stella，同時還用出核抑製劑來處理細胞。結果顯示，只有未被出核抑製劑處理、表達野生型Stella的細胞中，UHRF1才能正常定位在細胞質中，這證明Stella是招募UHRF1出核的重要元件。

Stella表達（上）和缺失（下）時UHRF1定位的差異[8]

考慮到UHRF1對DNA甲基化的調控作用，研究者接下來利用基於高通量測序的RRBS技術對不同時期卵母細胞的基因組甲基化水平進行了檢測。在缺失Stella的卵母細胞中，基因組CpG位點甲基化水平相比Stella表達正常的卵母細胞會在發育後期具有顯著的上升；而Stella缺失個體的精子基因組甲基化水平並未變化，其生殖能力也不受影響。卵母細胞基因組中新出現的超甲基化區域包括多種重複序列和多數發育相關基因，而在母系或父系印記基因的差異甲基化區域（DMR）的DNA甲基化基本是正常的。這表明，在卵子形成中Stella是正確建立卵母細胞甲基化組所必需的。

通過對比早晚期卵母細胞的甲基化組，研究者定義了卵母細胞獲得性甲基化區域（ooAMRs）。缺失Stella的卵母細胞相比正常卵母細胞有大量額外ooAMR存在。但在Stella與UHRF1雙敲除小鼠中不存在這些額外ooAMR，甲基化水平與正常小鼠相近。由此來看， Stella是通過限制UHRF1參與的起始性甲基化過程來防止卵母細胞過度甲基化。

Stella缺失帶來的甲基化組改變對胚胎髮育具有重大影響。研究者發現，超過半數Stella敲除卵子與正常精子形成的胚胎停滯於2細胞期向4細胞期的轉變過程中，能發育至囊胚期的不足15%，表明Stella缺失引發的UHRF1異常會導致胚胎髮育缺陷。對受精後合子的RRBS檢測顯示，在Stella缺失母方的雌原核中額外ooAMR的去甲基化水平很低，這甚至會影響雄原核的正常去甲基化，導致整個合子基因組超甲基化，進而改變合子基因組激活（ZGA）基因的表達水平，特別是其中來自母方的ZGA基因表達。

在以往研究中，通常認為DNMT3A在起始性甲基化過程中起到作用。因為缺少作為起始性甲基化酶的直接證據，DNMT1往往被認為是維持性甲基轉移酶。但在本文中，研究者觀測到Stella缺失卵母細胞中DNMT1定位於UHRF1的富集區，但未發現DNMT3A的亞細胞定位發生。這促使他們進一步驗證DNMT1和DNMT3A在基因組甲基化特徵變化過程中起到的作用。通過分別敲除DNMT1和DNMT3A，研究者發現DNMT3A在對照組卵母細胞的甲基化組建立中起到主導作用；但在Stella缺失卵母細胞的異常甲基化區域中81%依賴於DNMT1，受到DNMT3A影響的僅3.8%。特別是在Stella和DNMT3A雙敲除的卵母細胞中，其基因組整體甲基化水平甚至高於對照組。這些證據綜合起來，第一次系統而充分地證明了DNMT1在體內具有很強的起始性甲基化酶活性。

UHRF1和DNMT1的共定位[8]

DNMT3A與DNMT1各自對卵母細胞基因組甲基化的影響[8]

在研究基因組DNA的甲基化情況過程中，研究者利用了多種基於高通量測序及質譜法的甲基化檢測技術，保證了結論的嚴謹性。安諾基因有幸承擔本研究主要的高通量測序相關工作，為這一教科書級別研究添磚加瓦。安諾基因目前提供全面的表觀基因組測序服務，包括WGBS、scWGBS、MeDIP-seq、ChIP-seq和ATAC-seq等多項技術，滿足各位科研工作者的不同研究需求~

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參考文獻：

[1] Shirane K, Toh H, Kobayashi H, et al. Mouse oocyte methylomes at base resolution reveal genome-wide accumulation of non-CpG methylation and role of DNA methyltransferases[J].PLoS Genet, 2013, 9(4):e1003439.

[2] Smallwood S A, Tomizawa S, Krueger F, et al. Dynamic CpG island methylation landscape in oocytes and preimplantation embryos[J]. Nat Genet, 2011, 43(8): 811-4.

[3] Stewart K R, Veselovska L, Kelsey G. Establishment and functions of DNA methylation in the germline[J]. Epigenomics, 2016, 8(10): 1399-1413.

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[5] Sato M, Kimura T, Kurokawa K, et al. Identification of PGC7, a new gene expressed specifically in preimplantation embryos and germ cells[J]. Mech Dev, 2002, 113(1): 91-4.

[6] Saitou M, Barton S C, Surani M A. A molecular programme for the specification of germ cell fate in mice[J]. Nature, 2002, 418(6895): 293-300.

[7] Funaki S, Nakamura T, Nakatani T, et al. Inhibition of maintenance DNA methylation by Stella[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014,453(3): 455-60.

[8] Li Y, Zhang Z, Chen J, et al. Stella safeguards the oocyte methylome by preventing de novo methylation mediated by DNMT1[J]. Nature, 2018, 564(7734): 136-140.

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