類器官研究進展——類腦（上）

韓津 中科院再生醫學

如果有人問，類腦有什麼用，可以代替人類思考嗎？很遺憾的，目前還不能。然而，作為一個重要的技術平台，類腦能夠讓我們更好的了解人類的腦組織是如何形成的，或者人類的腦組織是怎麼生病的。本期，我們將向您詳細介紹類腦（brain organoid）——腦發育和疾病研究的新平台

由於無法對人類的組織和器官直接開展研究，科學家們對腦（神經系統）的在體研究主要通過模式生物（生物學家通過對選定的生物物種進行科學研究，用於揭示某種具有普遍規律的生命現象，這種被選定的生物物種就是模式生物，如：線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠等）。

科學家通過對模式動物使用藥物或者基因改造的方法影響腦發育過程中的一些重要調控信號，從而確定某些特定的信號分子對腦發育的作用，或發現一些腦發育過程中的規律。在小鼠等模式動物中建立帕金森、亨廷頓舞蹈症、譜系自閉症等模型，在模式動物中研究發病機制和藥物等治療手段的有效性。

然而，模式動物畢竟不是人類，即使是與人類最為接近的巨猿，其腦組織的結構和發育特徵還是與人類有一定差別。再加上腦組織的發育是伴隨著胎兒在子宮內的生長而發生的，對人類組織進行研究還存在著很大的倫理挑戰。

也許有人會說，繞過模式動物差別和倫理挑戰兩座大山，我們也可以在體外實驗室的培養皿里研究腦的發育啊。在類器官技術尚未發展之前，實驗室的培養皿中培養人類大腦，簡直是無法想像的難題。因為傳統的細胞培養技術，是細胞們躺在培養皿的表面，手拉著手肩挨著肩的一個扁平二維的培養體系，相對於人腦組織這樣一個立體的多細胞的複雜組織來說，二維培養的方式是難於在體外重建腦組織的（但我們也決不能無視二維培養技術的價值，直到現在，科學家們仍在利用二維培養研究出了大量的重量級的生物發現）而利用類器官技術獲得的類腦，它的重要特點就是具有三維的結構，由多種細胞組成，與人腦具有一定相似性的體外組織結構。可以說類腦在一定程度上解決了在培養皿中研究腦組織的技術難題。

圖1 人的多能幹細胞形成的類（大）腦組織，可見到神經前體細胞和神經元1

類腦技術的發展

類腦技術是由擬胚體技術發展而來的。擬胚體是通過讓胚胎幹細胞或多能幹細胞脫離自我更新環境誘導其分化，胚胎幹細胞或多能幹細胞自發形成的一種多細胞的聚集體。研究發現，擬胚體的分化過程類似於胚胎在子宮內的早期分化。而科學家們發現擬胚體在matrigel膠包被的培養皿中，可以自發的向神經系統的細胞分化，並進一步的形成具有「頂部-底部」極性的神經上皮細胞和放射性膠質細胞。

最初這種擬胚體自發向神經系統分化模擬神經系統發育的研究是在二維的培養體系下以一種假復層的形式出現的2。隨後，發展為懸浮成球的三維培養形式3，2011年，一種人胚胎幹細胞三維培養體系下通過誘導細胞的自我組織而形成的視杯樣結構很好的模擬了視網膜的結構4。

近幾年中，類腦技術還在不斷進步，三維的類腦組織可以模擬大腦的某些結構，並被稱為「類大腦」，在這些類大腦中，可以實現對皮層結構的模擬，而皮層正是大腦實現信息處理的重要結構。除了自發分化的方法，利用外源信號分子的模擬發育早期命運決定信號誘導類（大）腦形成的方法中也不容忽視。雖然誘導類（大）腦的方法很多，但目標都是讓獲得的類腦更穩定、更成熟、結構的複雜度更高、更接近於人類的（大）腦。

圖2 通過體外培養形成的類腦組織，左圖中白色箭頭所示為可見液體流動的腦室結構，右圖中黑色箭頭所示為視網膜色素上皮結構1

類腦技術的應用

第一部分：腦發育的模擬

雖然神經學的研究可以追溯到幾百年前的文藝復興時期，然而神經系統作為人類體內最為複雜的系統，它是如何從神經上皮的幾十個細胞發育為由成百上千神經細胞組成的神經系統，人類至今尚未參透其中奧妙。通過模式動物、二維培養、神經解剖學和組織學……人類利用多種手段一層層揭開神經系統的面紗，類腦技術的建立和發展更為神經系統發育的研究裝備了新的利器。

一、模擬人類神經發育

幾乎所有的類腦模型中我們都可以看到放射性膠質細胞、中間前體細胞、深層以及表層神經元按照與大腦發育類似的時間順序出現在類腦組織中。這顯示了類腦技術在模擬神經系統發育方面的優勢1。

更重要的是，類腦組織可以產生在模式動物小鼠中缺失的細胞類型和發育過程。比如一類位於大多數靈長類動物大腦室管膜下區外側的外側放射性膠質細胞（Outer radial glia cells, oRG）。oRG細胞在鼠的腦中是不存在的，鼠作為腦發育模式動物是無法研究oRG細胞的發育和功能的，然而科學家們在類腦中利用標誌物的標記和單細胞測序技術發現了oRG細胞的產生，這為科學家們在體外研究oRG細胞的發育提供了可能5。

皮層的擴展和摺疊形成溝回這樣的發育過程，也是無法在鼠腦的發育模型中研究的。2017年，Li, Yun等科學家利用類腦技術發現了調控皮層擴展和摺疊的信號分子，為腦皮層溝回形成的研究提供的重要數據6。

圖3 利用人多能幹細胞形成的類腦組織中，如果抑制PTEN信號，可以促進類腦組織表面結構的延展並摺疊形成褶皺結構。這樣的作用在鼠多能細胞形成的類腦中並沒有被發現（Li,Y. et al., Cell Stem Cell ,2017）

二、獲得多種類型的神經細胞

類腦組織的細胞的種類和多樣性能否模擬人腦？科學家們通過RNA測序方法對類腦組織的細胞組成進行了分析發現，體外培養100天的類腦組織的轉錄組與孕17-24周的人腦相似7。更精確的單細胞測序研究進一步證明了類腦組織細胞的多樣性和複雜性，但也提示了一些形成類腦的方法可能會引入中胚層細胞（神經細胞屬於外胚層），或者某些類型的細胞只能在某種特定方法生成的類腦中產生。

除了通過自發分化的的方法獲得類腦組織，科學家們還試圖通過外源加入一些已知的發育調控信號分子獲得一些並不常見的神經細胞。

三、類腦融合技術研究複雜神經結構

通過加入外源因子，可以誘導多能幹細胞形成類腦組織，通常這種類腦組織與通過自發分化形成的類腦組織相對應，被稱作外源類腦組織，而由自發分化而來的則稱為內源類腦組織。

將不同的外源類腦組織進行融合獲得複雜的神經結構為科學家研究複雜神經結構的形成過程提供了平台。其中最為成功的是中間神經元遷移模型8。利用不同外源因子誘導分別獲得模擬富含興奮性神經元的背側皮層類腦和模擬富含抑制性神經元的腹側皮層類腦，通過將這兩種類腦融合，科學家們在背側類腦中發現了抑制性中間神經元的遷入。

這個模型很好的模擬了體內中間神經元的遷移過程，已經有科學家利用該模型研究外源信號分子對神經元遷移作用。

圖4 用紅色和綠色熒游標記的人多能幹細胞分別向背側和腹側皮層類腦誘導，當這兩種類腦共同培養時發現，它們能夠融合併看到其內部大量腹側類腦細胞向背側類腦遷移（Bagley,J.A. et al., Nat Methods, 2017）

四、應用於腦發育過程的表觀遺傳學研究

科學家們還將類腦組織用於研究胚胎期表觀遺傳學信號分子對神經發育的影響，研究中雖然發現了一些與體內發育類似的DNA甲基化行為，但也有一些表觀遺傳現象並不存在於人類的腦中9。這一研究提示我們類腦技術還需要進一步的完善，使其更好的模擬腦的發育過程。

五、研究組織器官發生中的組織者

不論了外源還是內源類腦組織，類腦的形成在一定程度上都需要內部的自我組織。在體內，一個稱為「皮層下擺」的細胞群體，他們表達WNT、BMP等信號分子，被認為擔負著腦發育過程中組織者的職能。科學家們在類腦組織中也發現了一群類似的細胞，他們表達WNT和BMP信號，這群細胞可能模擬了腦形態建成過程中組織者的作用10。

六、研究功能皮質迴路的形成

形成功能皮質迴路的關鍵在於神經元之間形成能夠傳遞信號的突觸連接，而神經元之間形成功能性的突觸連接是幹細胞分化為神經元後更加重要的發育過程，這一過程從胚胎期開始伴隨著人類的成長，與人類的學習、認知、記憶等活動有著密不可分的關係。

在類腦組織中是否觀察到功能皮質迴路呢？在自發分化180天的類腦組織和由外源類腦組織融合形成的中間神經元遷移模型中均觀察到了谷氨酸能神經元與GABA能神經元形成的功能迴路。電生理實驗檢測到功能神經信號的傳導，掃描電子顯微鏡觀察到突觸結構，這些都說明，類腦組織中的神經元是可以形成突觸連接並進而形成功能皮質環路的11。這將為神經迴路形成的研究提供體外的研究平台。

未完待續……類腦（下）將繼續為大家介紹類腦技術在腦疾病模擬中的應用，以及類腦技術的未來與挑戰，敬請期待。

參考文獻：

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Li, Y. et al. Induction of Expansion andFolding in Human Cerebral Organoids. CellStem Cell 20, 385-396 e3 (2017).

Camp, J.G. et al. Human cerebral organoidsrecapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 15672-7 (2015).

Bagley, J.A., Reumann, D., Bian, S.,Levi-Strauss, J. & Knoblich, J.A. Fused cerebral organoids modelinteractions between brain regions. NatMethods 14, 743-751 (2017).

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Kadoshima, T. et al. Self-organization ofaxial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitordynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A 110,20284-9 (2013).

Birey, F. et al. Assembly of functionallyintegrated human forebrain spheroids. Nature545, 54-59 (2017).

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