人造血小板走向臨床應用

引言

血小板的主要功能是止血。因疾病等各種原因導致的血小板數量偏低，都會威脅到生命安全。和《工作細胞》里展現的不同的是，血小板的壽命只有7-14天，體外的血小板保存5天就不能使用了。

每年的夏冬兩季，基本全國很多地方都會出現血小板荒，今年尤甚，具體原因我想大家一定是知道的。

和獻全血不一樣，血小板的捐獻認知度更低，每次捐獻需要的時間也更長。市場的需求正逐年遞增。

科學家和醫務人員早就注意到，依靠人類捐獻的血小板，肯定是無法滿足患者的需求的。因此，人工合成血小板就成了科學家解決問題的方向。

然而，經過多年的不斷嘗試，人工生產的血小板始終達不到臨床使用的標準。這嚴重阻礙了人工生產血小板的臨床使用。

近日，來自京都大學大學的Koji Eto團隊終於解決了這個問題。首次實現了臨床應用級別的人工血小板生產。Eto教授更是不無自豪地說，「我們的這個發現是人造血小板走向臨床應用的最後一個科學步驟。」

近日，Eto團隊的這一重要研究成果發表在頂級期刊《細胞》上[1]。

通訊作者Koji Eto

血小板來自骨髓和肺中的巨核細胞產生的碎片[2]，這兩個來源是去年年初才正式確定的。

科學家很早就想到了通過體外培養巨核細胞生產血小板。不過巨核細胞的獲取並沒有那麼容易。人誘導多能幹細胞（hiPSCs）技術的成熟，讓這個問題迎刃而解。

近年來，已經有科學家利用人誘導多能幹細胞（hiPSCs），分化出永生化的巨核細胞系（imMKCL），再用這些巨核細胞生產血小板[3-5]。

但是，現實總是殘酷的。正常情況下一次治療需要2000-3000億個血小板。可無論研究人員花了多大的心思，他們的血小板生產規模一直達不到臨床使用的數量級。

背後的原因，研究人員百思不得其解。

直到有一天，Eto團隊的研究人員在做實驗的時候偶然發現，晃動培養瓶能增加血小板的產量。這似乎暗示水平搖動引起的物理應力增強了血小板的生成。

觀察到這個現象之後，研究人員很快就在一個20L的波動系統中進行了實驗。雖然巨核細胞能持續在裡面增殖，但血小板產量和質量並沒有提高。他們猜測，可能還是流體參數不對。

實際上，早在2007年，就有研究表明，小鼠骨髓中的巨核細胞受到的血流剪切應力，對血小板的生成非常重要[6]。

於是，基於之前的探索性成果，他們嘗試在生物反應器中重現巨核細胞在骨髓中承受的血流剪切應力。遺憾的是，他們改進的反應器生產水平仍舊非常低。每個巨核細胞只能生產14個血小板。而在體內，一個巨核細胞產生血小板的量在500-1000個左右。

如此看來，單獨的剪切應力似乎並不是決定性因素啊。他們認為，一定漏掉了什麼東西。

使用雙光子活體成像觀察血小板的脫落過程

於是，他們決定在回到體內一探究竟。

研究人員首先給小鼠骨髓中的巨核細胞做了綠色熒游標記，然後用雙光子顯微鏡和粒子成像速度場儀（PIV）觀察了小鼠顱骨骨髓中的血小板生成過程。結果發現那些大量產生血小板的巨核細胞處於湍流之中，而處於靜息狀態，不產生血小板的巨核細胞周圍則是層流。

血小板竟然是被湍流亂棒「打」下來的！

在湍流中血小板從巨核細胞上脫落

圖中綠色的是血小板和巨核細胞，紅色是血流，藍色是細胞核

湍流和層流是流體流動的兩種狀態。當流速很小時，流體分層流動，互不混合，稱為層流。隨著流速的增加，流體的分層結構被破壞，不同流層間相互混合，稱為湍流。Koji Eto說：「已經有很多人在生物反應器上下功夫了，但他們都是用的層流，沒人想到用湍流。」

隨著流速變快，水流由層流變成湍流

在回頭去看他們之前用到的反應器，確實缺少足夠的湍流，而這可能就是血小板脫落的關鍵。

發現湍流的重要性之後，研究人員又開始尋找新的反應器。通過各種模擬測試之後，他們發現一種叫做VerMES的垂直往複運動式液體培養生物反應器似乎能行。

在2.4升的反應器里，當VerMES的葉片以300毫米/秒的速度做上下往複運動時，每個巨核細胞能產生70-80個血小板，產量比原來提高5倍。而且，這種條件下產生的血小板質量也特別好。

進一步分析顯示，VerMES生物反應器不僅能形成剪切應力，還能產生足夠水平的湍流和渦流。

VerMES生物反應器

有了這個初步的成功，研究人員就要計算出背後的模式了。於是他們又做了一個0.3升的反應器，探索出了這個體積的反應器，葉片的最適運動參數。

有了這兩組數據，研究人員很快就摸索出在8升的生物反應器中葉片的運動距離和速度。最終他們發現，葉片的上下運動範圍是40毫米，葉片的運動速度是150毫米/秒。在這樣的參數條件下，Eto團隊成功在8升的生物反應器中生產了1000億個血小板。

終於達到了臨床使用的規模。

當然，僅生產出來血小板是不夠的，還得看看血小板的功能怎麼樣。接下來研究人員又比較了生產的血小板和志願者捐獻的血小板的功能。

電鏡下iPSC生產的血小板

研究人員首先在電鏡下觀察了兩種血小板，imMKCL產生的血小板比捐獻的要大，而且大小更不均勻，但也有完整的血小板結構以及α顆粒（血小板中的可分泌蛋白儲存在α顆粒中）。體外的血小板聚集實驗中，兩者的表現也相似。

為了進一步確認生產的血小板在體內的功能，研究人員又在兩個動物模型中進行了實驗。

研究人員首先用2.4Gy的電離輻射照射小鼠，以抑制它的造血功能。在照射後第9天，也就是自身血小板最低的時候，研究人員給小鼠分別輸入了生產的血小板和志願者捐獻的血小板， 比較了血小板的動力學和出血時間，兩者都是相似的。

兩種血小板都能在血管內形成血栓

然後，研究人員又在能更好評價血小板止血能力的兔模型中進行了實驗。研究人員先用白消安抑制動物自身的血小板生成，在2周後注射棕櫚酸乙酯以抑制網狀內皮系統，避免輸入的血小板被破壞。之後輸入兩種血小板，並切開耳緣靜脈，比較出血時間。兩種血小板顯示出的止血能力還是相似的。

有了以上的數據和表現，Eto認為，「我相信，我們的這個發現是人造血小板走向臨床應用的最後一個科學步驟。」[7]

目前，Eto團隊正在通過設計自動化生產方案，進一步擴大生產規模，以期進一步提高產量、降低成本。

此外，他們還順手解決了配型的問題。他們開發了一種通用血小板，這種血小板表面沒有人類白細胞抗原，輸入人體不會產生免疫排斥反應。儘可能的擴大人工生產血小板的適用人群。

據Eto估計，在未來的1-2年，他們將開展臨床研究。或許在2020年之後，血小板荒有望解除。

參考資料：

[1]. Ito Y, Nakamura S, Sugimoto N, et al. Turbulence Activates Platelet Biogenesis to Enable Clinical Scale Ex Vivo Production[J]. Cell, 2018.

[2]. Lefran?ais E, Ortiz-Mu?oz G, Caudrillier A, et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors[J]. Nature, 2017, 544(7648): 105.

[3]. Sim X, Poncz M, Gadue P, et al. Understanding platelet generation from megakaryocytes: implications for in vitro–derived platelets[J]. Blood, 2016, 127(10): 1227-1233.

[4]. Moreau T, Evans A L, Vasquez L, et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming[J]. Nature Communications, 2016: 11208-11208.

[5]. Nakamura S, Takayama N, Hirata S, et al. Expandable Megakaryocyte Cell Lines Enable Clinically Applicable Generation of Platelets from Human Induced Pluripotent Stem Cells[J]. Cell Stem Cell, 2014, 14(4): 535-548.

[6]. Junt T, Schulze H, Chen Z, et al. Dynamic Visualization of Thrombopoiesis Within Bone Marrow[J]. Science, 2007, 317(5845): 1767-1770.

[7].https://www.sciencedaily.com/releases/2018/07/180712114600.htm

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