生物物理所揭示噬菌體防禦CRISPR-SpyCas9的分子機制

2018年12月31日，《分子細胞》（Molecular Cell）雜誌在線發表了中國科學院生物物理研究所王艷麗課題組在CRISPR-Cas系統研究中取得的最新進展。標題為Phage AcrIIA2 DNA Mimicry: Structural Basis of the CRISPR and Anti-CRISPR Arms Race。該研究工作成功解析了Anti-CRISPR 蛋白AcrIIA2 與Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) 蛋白及single-guide RNA (sgRNA) 的三元複合物3.3 埃的晶體結構，並結合體內和體外的功能實驗，系統地闡述了噬菌體運用Anti-CRISPR 蛋白防禦CRISPR-SpyCas9系統的分子機制。王艷麗課題組一直致力於CRISPR-Cas系統抗病毒作用機理的研究，前期研究揭示了一系列重要的CRISPR-Cas系統的作用機理 (Nature 2014, Cell 2015, Cell Res. 2016, Cell 2017a, Cell 2017b, Mol. Cell 2017, Cell 2018)；該工作是王艷麗課題組首次在Anti-CRISPR蛋白防禦CRISPR-Cas系統作用機理的研究中取得突破。

CRISPR/Cas系統是古菌和細菌抵抗病毒和質粒侵染的重要免疫防禦系統。CRISPR-Cas系統劃分為兩大類，第一大類CRISPR-Cas系統由多亞基組成的效應複合物發揮功能；第二大類是由單個效應蛋白（如Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas13等）來發揮功能。其中，Cas9, Cas12a, Cas12b均具有RNA介導的DNA核酸內切酶活性，Cas13a具有RNA介導的RNA核酸酶活性。面對細菌的免疫系統（CRISPR-Cas），噬菌體也相應進化出了自己的防禦系統（Anti-CRISPR）。2017年首次發現了Listeria monocytogenes 噬菌體來源的四個Anti-CRISPR蛋白，AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 和AcrIIA4。研究發現AcrIIA2和AcrIIA4蛋白在細胞內能夠抑制SpyCas9的基因編輯活性。隨後的結構和功能研究表明AcrIIA4通過阻斷DNA與SpyCas9的結合來抑制SpyCas9的功能，然而AcrIIA2抑制SpyCas9活性的分子機制一直未能闡述清楚。

在該研究中，研究人員首先通過生化實驗發現AcrIIA2隻與結合有sgRNA的SpyCas9二元複合物結合，並不與自由狀態下的SpyCas9結合，也並不與同時結合有sgRNA和dsDNA的SpyCas9三元複合物結合。為了研究AcrIIA2直接抑制SpyCas9活性的分子機制，研究人員利用X-ray晶體學的方法成功解析了AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA的三元複合物晶體結構（3.3 埃）。結構發現AcrIIA2是由三個α螺旋及一個β摺疊組成的緊湊結構，它結合在SpyCas9的一個帶正電荷的凹槽區域。該區域由PI、HNH、WED和REC2結構域形成。PI結構域上R1333和R1335是識別dsDNA的PAM序列的關鍵氨基酸，AcrIIA2通過與R1333和R1335形成穩固的氫鍵從而阻斷SpyCas9對PAM序列的識別，進而阻止SpyCas9對dsDNA的結合。而AcrIIA2的α1螺旋與HNH結構域的相互作用可以錨定HNH結構域，阻止其結合DNA必須發生的構象變化。另外，通過結構比對分析發現AcrIIA2有大量的帶負電荷的氨基酸佔據著dsDNA中PAM結合的位置，這表明AcrIIA2模擬帶負電荷的DNA與SpyCas9結合從而阻止DNA與SpyCas9的結合。有趣的是，競爭性結合實驗表明AcrIIA2並不能取代已經與SpyCas9-sgRNA結合的dsDNA，而dsDNA也不能取代已經與SpyCas9-sgRNA結合的AcrIIA2。總之，通過結構和功能實驗的證明，AcrIIA2主要通過三個步驟來抑制dsDNA的結合。首先，AcrIIA2可以阻斷PAM的識別；其次，AcrIIA2佔據了dsDNA的結合位點；最後，AcrIIA2通過限制HNH結構域的構象變化來抑制dsDNA的結合。

目前，SpyCas9蛋白作為基因組編輯工具被廣泛應用於DNA領域的基因編輯，克服了傳統基因編輯技術步驟繁瑣、耗時長、效率低等缺點，以其較少的成分、便捷的操作以及較高的效率滿足了大多數領域的基因編輯需求，並有著潛在的臨床應用價值。但是CRISPR-SpyCas9基因編輯系統也存在著一定的脫靶問題，該研究對Anti-CRISPR 蛋白抑制SpyCas9活性分子機制的闡述為控制或終止SpyCas9活性提供了新的參考和思路。有望將Anti-CRISPR 蛋白開發成新的基因編輯終止工具，實現精準基因編輯。

王艷麗為論文通訊作者。王艷麗課題組的劉亮為論文第一作者。該研究得到科技部、國家自然科學基金以及中科院戰略性先導科技專項（B類）的資助，上海同步輻射光源（SSRF）以及日本同步輻射光源SPring-8為該研究提供了重要的技術支持。

圖註：AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA三元複合物的晶體結構。（A）SpyCas9的結構域；（B）AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA三元複合物的結構展示圖。

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