基因編輯技術應用現狀

生命科學的迅速發展使得我們從生物遺傳信息的「讀取」階段進入到後基因組時代，基因組的「改寫」乃至「全新設計」正逐漸成為現實。在不斷的探索研究中，基因編輯技術已經從最初依賴細胞自然發生的同源重組，發展到幾乎可在任意位點進行的靶向切割，其操作的簡易和高效極大地推動了物種遺傳改造的發展。基因編輯可為合成生命的進一步改造提供手段，為新物種的創造提供更多的可能性。

基因編輯主要包括鋅指核酸酶(ZFN) 技術、轉錄激活子樣效應物核酸酶(TALEN) 技術、CRISPR-Cas核酸酶(CRISPR-Cas RNAs) 技術，它們都能特異性地識別靶位點，對其單鏈或雙鏈進行精準切割後，並由細胞內源性的修復機制來完成對靶標基因的敲除和替換。由於CRISPR-Cas9系統構建相對容易且細胞毒性小，目前應用最為廣泛。

（a）鋅指核酸酶（ZFN）基因編輯技術；（b）TALEN 基因編輯技術；

（c）CRISPR/Cas9 基因編輯技術

CRISPR/Cas系統應用

1 CRISPR/Cas9 技術

CRISPR/Cas 系統原本是細菌和古菌進化出來用於抵禦外來病毒及質粒 DNA 的適應性免疫系統。II 型CRISPR/Cas9系統依賴於外源 DNA 片段在規律成簇的短間隔迴文重複（CRISPR）位點整合，其經過轉錄及剪切後產生短的 CRISPR RNAs（crRNAs），crRNA 與反式轉錄的 crRNA（tracrRNA）退火結合，然後引導 Cas9蛋白介導序列特異性的外源 DNA 降解[1]。Jinek等[2]發現Cas9 發揮靶向切割作用所依賴的 crRNA 和 tracrRNA 可以融合為一體，作為 sgRNA。隨後，若干研究組陸續報道 CRISPR/Cas9 系統可用於人類細胞的靶向基因編輯[3]。

2 CRISPR/Cas9-nickase 基因編輯技術

RISPR/Cas9系統使用的 crRNA 能容受一定程度的錯配導致脫靶效應的產生，限制了 CRISPR/Cas9 系統在高精度編輯中的應用[4]。為了提高Cas9編輯系統的精度，研究者設計了「一個位點，雙 sgRNA 靶向」的策略，即只對HNH或RuvC的其中一個位點進行沉默突變，形成和Cas9 nickase，這樣就可以用兩個不同的nickase對基因組進行錨定和單鏈剪切造成粘性末端。使用這種策略，可以大大降低CRISPR/Cas9 系統的脫靶效率。

3 CRISPR/dCas9-FoKI基因編輯技術

同樣是為了解決 CRISPR/Cas9 技術的脫靶問題，Guilinger 等[5]採用了dCas9的策略，即對HNH和RuvC活性區域進行突變，使之無法行駛剪切功能而產生Dead Cas9(dCas9)，dCas9隻能依據sgRNA上的序列附著到特定的基因位點上，而不可以行駛剪切功能。為了實現 DNA 的切割，引入FoKI 核酸內切酶的切割結構域，與dCas9連接做成融合蛋白fCas9。在人類細胞的基因編輯中，fCas9 的特異性比野生型Cas9要高得多，同時也大大降低了脫靶效率。

(a) CRISPR/Cas9 技術 (b)CRISPR/Cas9-nickase 基因編輯技術

(c)CRISPR/dCas9-FoKI基因編輯技術

4 基於 CRISPR/dCas9 的單鹼基編輯技術

（1） Liu課題組將源自大鼠的胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）與 dCas9 融合，從而使得胞嘧啶經脫氨基形成尿嘧啶，尿嘧啶在複製過程中被識別為胸腺嘧啶，實現C到T的轉換,然後在後續的 DNA 複製或者修復作用下實現 C : G 鹼基對到 T : A 的轉變[6]。

（2）腺嘌呤經脫氨基形成次黃嘌呤，次黃嘌呤在複製過程中被識別為鳥嘌呤，從而可實現A到G的轉換。Liu 課題組採用蛋白質進化工程手段對大腸桿菌的 tRNA 腺苷脫氨酶（TadA）進行改造，他們獲得的第 7 代腺嘌呤鹼基編輯器（adenine base editors，ABEs）能高效介導 A : T 鹼基對到 G : C 轉變[7]。

5 基於 CRISPR/dCas9 的基因表達調控技術

除了直接對 DNA 進行編輯，CRISPR/Cas 系統在基因表達調控上也可發揮作用[8]。例如，利用dCas9無核酸內切酶活性但仍能與DNA結合的特點，可直接阻礙其結合 DNA 與其他因子的結合，影響基因的表達。如果將轉錄抑制因子或者激活因子與dCas9融合，則可以實現靶基因的抑制與激活，為基因功能研究提供靈活的操作手段。

6 CRISPR/Cas12a 基因編輯技術

2015 年，張鋒團隊報道 V 型系統中的 Cpf1（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）（現稱「Cas12a」）是有功能的細菌免疫機制並能在人類細胞中介導有效的基因編輯[8]。CRISPR/Cas12a 需要的是富含 T 鹼基的 PAM 序列，有助於其在基因組富含 A/T 鹼基的物種中使用。陳佳課題組將無 DNA 切割活性的 dCas12a 與大鼠源的胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）融合，發現其與基於 Cas9 的鹼基編輯器類似，能有效地催化人類細胞中 C 到 T 鹼基的轉換[9]。由於識別的是富含 T 鹼基的 PAM 序列，基於 Cas12a 的鹼基編輯系統能與基於 Cas9 的鹼基編輯系統互補，為相關基礎研究及將來的臨床應用提供更全面的技術條件。

7 基於CRISPR/Cas 系統的RNA編輯技術

除了對 DNA 進行編輯，張鋒課題組發現 CRISPR 蛋白家族的 C2c2（現稱 Cas13a）可以靶向切割 RNA[10]，隨後他們證實 Cas13a 可在哺乳動物細胞中靶向降低 RNA 的水平[11]。利用 Cas13a 的 RNA 靶向功能，CRISPR/Cas13a系統被開發為 RNA 檢測器用於疾病診斷[12]。張鋒團隊後續又發現了 Cas13b[13]，其同樣具有 RNA 靶向和編輯功能。另外，Cas13c 和 Cas13d 也具有類似功能[14]。RNA 編輯技術的建立，進一步拓展了 CRISPR/Cas 基因編輯技術的應用範圍。

（來源：南開細胞工程）

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