調控造血幹細胞發生的長鏈非編碼RNA
Cell Stem Cell 專家點評 | 蘭雨/余佳/劉兵合作組首次揭秘調控造血幹細胞發生的長鏈非編碼RNA
點評丨程濤（中國醫學科學院）；單革（中國科學技術大學）
眾所周知，造血幹細胞(Hematopoietic stem cell，HSC) 因其具有自我更新和多向分化潛能，可終生貢獻機體所需的各類血細胞。小鼠胚胎髮育早期，第一個具有長期重建成體造血系統潛能的HSC出現於胚胎期第10.5天（E10.5），其起源於多個血管位點，包括主動脈-性腺-中腎(AGM)區、頭部和卵黃囊。近期一系列研究發現，AGM區主動脈腹側的一群特化的血管內皮細胞，可通過內皮-造血轉化，歷經HSC前體（pre-HSC），最終生成HSC（圖1）【1】。然而，HSC發育過程中，pre-HSC和HSC等關鍵細胞數量稀少，發育時間窗短，且缺乏特異性表面標誌，對其精確研究異常困難。
圖1. 小鼠胚胎造血細胞起源階段及位點。胚胎造血分為3個階段，其中定向造血（Definitive/HSC）主要發生在以AGM區為代表的多個位點，通過內皮-造血轉化（EHT）產生HSC。（圖片來源：Elaine Dzierzak and Anna Bigas, Cell Stem Cell, 2018, https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.04.015.）
針對HSC發育調控機制的多個研究顯示，轉錄因子Runx1（及其下游靶基因Gfi1和Spi1）和Gata2等在內皮-造血轉化中發揮著不可或缺的作用。信號通路如BMP/TGF-β、Notch和mTOR等均參與調控HSC的發生（圖2）。迄今為止，非編碼RNA在HSC發育中的動態表達全貌和生理功能仍不清楚。其中，長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大於200個核苷酸，幾乎不具備蛋白質編碼潛能的RNA分子，其可與核酸和蛋白質發生廣泛相互作用來調節基因功能，在多種重要生命活動中發揮關鍵調控作用【2】。近期有研究發現骨髓HSC表達大量lncRNA，並鑒定出150餘個骨髓HSC特異表達的未注釋lncRNA，其中兩個在維持HSC自我更新和分化中具有功能【3】。
圖2. 造血幹細胞發育的調控機制。（圖片來源：Elaine Dzierzak and Anna Bigas, Cell Stem Cell, 2018, https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.04.015.）
1月10日，暨南大學蘭雨研究組、中國醫學科學院余佳研究組、軍事醫學科學院附屬醫院（現為解放軍總醫院第五醫學中心）劉兵研究組在Cell Stem Cell雜誌上發表了題為Combined Single-Cell Profiling of lncRNAs and Functional Screening Reveals H19 is Pivotal for Embryonic Hematopoietic Stem Cell Development的研究。該研究在國際上首次繪製了小鼠胚胎HSC發育全程的單細胞lncRNA動態表達圖譜，並結合體內外功能篩選鑒定出調控HSC發生的重要功能性lncRNA分子。
2016年，劉兵/湯富酬/袁衛平合作組在國際上首次採用單細胞孵育誘導移植，結合細胞表面標誌CD201的特異性高表達，實現了pre-HSC高達30%成功率的高效捕獲，同時聯合單細胞轉錄組測序技術，系統揭示了HSC生命周期全程的分子表達規律【4】。基於以上單細胞轉錄組數據，該研究首次描繪出HSC發育全程的lncRNA動態表達圖譜，並鑒定到一系列在HSC發育過程中全新未注釋的lncRNA分子。深入分析了lncRNA與其鄰近基因的表達關係，發現lncRNA與其鄰近的第一個蛋白編碼基因相關性更強，且他們的相對位置可能影響其調控關係。該研究進一步發現lncRNA相較於蛋白編碼基因對於不同時空HSC相關群體的異質性具有更好的甄別度。最後通過與重要蛋白編碼基因的基因座共定位或共表達分析對HSC發育全程動態變化的lncRNA進行了功能預測。
後續嚴格的生物信息學分析篩選獲得一組潛在的功能性lncRNA，並通過體外功能實驗發現6個可能在胚胎造血發育中發揮作用的lncRNA。利用條件基因敲除研究策略，著重闡明了lncRNA-H19對於AGM區HSC發生的重要作用。LncRNA-H19的缺失使得重要造血轉錄因子（包括Runx1及Spi1等）的啟動子區域高甲基化並下調其表達，以致血管內皮細胞向pre-HSC的轉化阻滯。機制研究發現胞漿定位的lncRNA-H19部分通過抑制甲基化調控分子SAHH的活性來調控目的基因的甲基化水平【5】，並且該調控功能與H19作為microRNA前體（pri-miR）可能加工產生的產物mir-675無關。而先前研究報道mir-675分子通過調控Igf1r-Igf2信號通路來維持成體HSC的靜息狀態【6】。
綜上，該研究首次揭示了在HSC發生過程中發揮重要功能的lncRNA，並系統闡述了lncRNA-H19在胚胎HSC發生與成體HSC穩態維持中完全不同的功能以及調控方式。這些認識將為全面理解lncRNA調控重要生物學過程的機制提供重要啟示，HSC發育全程的單細胞lncRNA圖譜也將為HSC發育和再生機制研究提供重要的資料庫和參考（圖3）。
圖3. 單細胞lncRNA圖譜構建及H19作用機制模式圖
軍事醫學科學院附屬醫院（現為解放軍總醫院第五醫學中心）副研究員周傑、博士研究生張琳琳，中國醫學科學院基礎醫學研究所博士後徐嘉悅、副研究員馬艷妮、博士研究生劉思琪為該研究論文的第一作者。蘭雨研究員、余佳研究員、劉兵研究員為該論文的通訊作者。
專家點評
程濤（中國醫學科學院教授、教育部"長江學者"，國家"傑青"）
造血幹細胞是已經被證實具有確切臨床治療價值的最經典的一類成體幹細胞。造血幹細胞的體外擴增和基因操作是進一步拓展諸如臍帶血造血幹細胞臨床應用和開展地貧等基因治療的先決條件。破解造血幹細胞體外操作這樣一個難題的根本生物學途徑之一，就是從發育的角度認識造血幹細胞的來龍去脈。因此深入研究造血幹細胞的起源以及發育的路徑，就顯得極為重要。
蘭雨/余佳/劉兵等聯合團隊在以往紮實的工作基礎上，利用劉兵/湯富酬團隊兩年多前發表於Nature的高質量的單細胞轉錄組測序數據，首次在單細胞尺度描繪了內皮細胞、造血幹細胞前體、定向造血幹細胞以及胎肝造血幹細胞等不同階段造血幹細胞的長鏈非編碼RNA表達譜，找到了眾多可能具有潛在功能的調控分子。
有趣的是他們發現了H19這個印記基因的lncRNA變化最為顯著，進而證實了H19-lncRNA對於AGM造血幹細胞的功能具有重要的調控作用，其部分作用是通過影響定向造血的兩個著名轉錄因子，Runx1和Spi1。因此該工作揭示了造血幹細胞發育的一個重要的表觀調控機制，為將來造血幹細胞體外擴增和基因修飾提供了新的分子干預靶點。
在這個重要的工作基礎上，進一步了解H19的作用網路、Runx1以外的分子調控機制、其他眾多lncRNA對造血幹細胞發育的影響、最後明確這些分子在人類造血幹細胞發育中起了什麼作用，是將來重要的研究方向。
程濤教授
中國醫學科學院血液病醫院（血液學研究所）常務副所院長，實驗血液學國家重點實驗室主任，北京協和醫學院幹細胞與再生醫學系創始主任，中國生理學會血液生理專業委員會創始主任委員。國際實驗血液學會唯一中國理事及其會刊Experimental Hematology副主編，血液學國際權威雜誌Blood首位中國編委。
程濤教授從事血液學專業30餘年，是我國造血幹細胞生物學的領軍學者。國家重大科學研究計劃（973）和重點研發任務首席科學家，基金委國家「傑出青年基金」、重大項目以及「創新研究群體」負責人。教育部和科技部創新團隊帶頭人。獲「千人計劃」國家特聘專家、「長江學者」特聘教授、「百千萬人才工程」國家級人選、「有突出貢獻」中青年專家等榮譽。
多年來，其研究團隊針對造血再生這一難題，圍繞造血幹細胞（HSC）的數量、質量和微環境的調控及惡變機制進行了長期而系統的研究，取得了一系列原創性成果，為HSC體外擴增、提高HSC體內再生效率和遏制白血病細胞生長提供了新策略，具有重要臨床應用前景。研究成果在Science、Nature Medicine、Nature Genetics、Nature Cell Biology 等期刊發表論文200餘篇，SCI文章平均影響因子8.5，谷歌學術查引9500餘次（SCI5000餘次）。獲授權專利11項。主編和參編專著中文3部、英文6部，對造血及幹細胞生物學的發展具有重要的學術貢獻和影響。
單革（中國科學技術大學生命科學學院，教授，國家「傑青」）
長鏈非編碼RNA研究的一個重要命題是長鏈非編碼RNA（lncRNA）的時空表達及生理功能。蘭雨/余佳/劉兵研究組合作發表在Cell Stem Cell上的論文，利用單細胞RNA測序（RNA-seq）數據描繪了7000多個在小鼠HSC (Hematopoietic stem cell，造血幹細胞) 發育全程的lncRNA動態表達圖譜，進而篩選出並詳細研究了H19這一長鏈非編碼RNA調控HSC發生的生理功能。
作者首先對六個HSC相關細胞群的單細胞測序數據進行了系統的生物信息學分析，從中發現了7300多個lncRNA，並且分析了它們的時空表達、與mRNA表達相關性、以及進化保守性等特點。非常有意思的是，lncRNA比mRNA具有更強的細胞特異性，暗示lncRNA在HSC相關細胞群時空分化上具有重要功能。尤其值得一提的是，作者還發現這七千多個lncRNA中，有400餘個是未有注釋的（unannotated）,說明即使在RNA測序已經盛行多年的情況下，像HSC相關細胞群這樣稀有的細胞類型中依然存在數量可觀的未知lncRNA。
隨後作者用以下三個標準分析篩選得到10個lncRNA：（1）從EC（早期胚胎中產生HSC相關細胞群的vascular endothelial cells）到T1 pre-HSC（第一類HSC前體細胞，CD45- type 1 precursors）被上調錶達的；（2）屬於pre-HSC指征（signature）lncRNA；（3）在至少三個物種中保守。進一步利用shRNA（short hairpin RNA）在原代細胞中敲低這10個lncRNA，發現其中H19的敲低對AGM（aorta-gonad-mesonephros）來源的CD31+細胞（其中包含幾乎所有HSC相關前體細胞群）增殖分化的負面影響最大。
H19是生物學家早在1990年即發現的、也是第一個被發現的長鏈非編碼RNA【1】。將近30年的研究已經發現H19具有多種生理功能及相關功能分子機理。H19既可以作為lncRNA也可以作為microRNA的前體產生miR-675來行使調控功能，並且與基因印記（imprinting）、多種腫瘤、數種人類疾病相關。蘭雨/余佳/劉兵研究組隨後利用H19條件敲除小鼠、在胚胎髮育早期研究H19敲除之後對HSC相關細胞群的影響。結果證實、H19確實對AGM區HSC的發生起到必不可少的作用。在分子機理上，H19通過抑制SAHH（S-Adenosylhomocysteine hydrolase）來影響重要造血轉錄因子的啟動子區域甲基化，從而調控血管內皮細胞向pre-HSC的轉化。作者還通過多組實驗表明H19的這一調控功能與其作為的microRNA前體而可能產生的miR-675沒有關係。這一研究讓人領悟到即使像H19這樣已被非常詳盡研究的lncRNA，依然可能具有重要的未知生理功能；而且暗示其它microRNA前體也有可能以長鏈非編碼RNA的形式行使不依賴於其產生microRNA的功能。
蘭雨/余佳/劉兵研究組這一工作非常好地利用了單細胞測序的特點和長處、擴展了我們對幹細胞尤其是HSC相關細胞群中長鏈非編碼RNA時空表達及生理功能的認知，也為該領域的進一步研究提供了資源（resource）和範式（paradigm）。
1. Brannan CI, Dees EC, Ingram RS, Tilghman SM. The product of the H19 gene may function as an RNA.Mol. Cell. Biol. 10 (1), 28–36 (1990).
單革教授
中國科學技術大學生命科學學院教授。1995年蘭州大學細胞生物學學士，1998中科院上海細胞所碩士，2004年美國喬治亞州立大學博士。先後在美國愛默蕾(Emory)大學和耶魯大學（導師Sidney Altman，RNA酶的發現人之一、1989諾貝爾化學獎）進行博士後研究。2010年進入中國科學技術大學工作。單革博士長期從事基因表達調控和非編碼RNA功能及功能機理方面的研究。發現了新的非編碼RNA類型（EIciRNA、5S-OT、ASAT siRNA、tiny RNA、p53點突變適配體RNA等）、研究了新的非編碼RNA功能、揭示了新的非編碼RNA作用機理、探索了新的非編碼RNA研究方法。實驗室成立以來先後在Genome Biology, Developmental Cell，Nature Structural & Molecular Biology，Nature Communications 和 PNAS等期刊發表多篇非編碼RNA領域的研究論文。先後獲得科技部「中青年科技創新領軍人才」（2016），基金委「國家傑出青年基金」（2017），國家「萬人計劃」科技創新領軍人才（2018）。
通訊作者簡介
蘭雨博士
暨南大學基礎醫學院研究員，博士生導師。2017年廣東省「珠江人才計劃」引進創新創業團隊帶頭人，中國生理學會血液生理學專業委員會青年委員。研究方向：血管及血液系統發育。主要基於條件基因敲除及系列單細胞技術，進行血管及血液系統發育的規律及譜系分析，探索重要信號通路在血管及血液系統發育和疾病中的功能和機制。作為負責人先後承擔國家重點研發計劃課題，國家自然科學基金委重大項目（課題）、重大研究計劃（培育項目）、面上項目等。發表SCI收錄論文20餘篇，通訊作者研究論文發表在Cell Stem Cell、Developmental Cell、Cell Research、Circulation Research、Blood 等雜誌。論文引用1000餘次（Google Scholar），3篇第一/通訊作者研究論文被FACULTY of 1000推薦。科研成果曾獲得國家自然科學二等獎（2012年，排名第4）。
余佳研究員
中國醫學科學院基礎醫學研究所RNA與幹細胞生物學研究組長，北京協和醫學院&中國醫學科學院首批長聘教授，國家傑出青年科學基金獲得者（2017），長江學者獎勵計劃入選者（青年，2017），中國醫學科學院RNA與造血調控研究重點實驗室主任，醫學分子生物學國家重點實驗室PI。研究方向為「RNA與幹細胞功能」，闡明：非編碼RNA基因簇在胚胎幹細胞和造血幹細胞譜系分化中的重要作用；LncRNA在造血幹細胞發生過程的重要功能；非編碼RNA加工對造血幹細胞譜系命運決定的調控機理。作為負責人承擔國家自然科學基金委重大研究計劃、重點項目及科技部973子課題。近5年來在Cell Stem Cell、Nature Medicine、Nature Communications、EMBO Journal、Cell Research、Cancer Research、Nucleic Acids Research、Autophagy等國際學術期刊上發表SCI論文20餘篇，總引用2000餘次。目前擔任全國血液生理專業委員會委員，北京市生化協會青年委員會主任、理事，全國實驗血液學青年委員會副主任。部分成果獲得教育部2018年自然科學二等獎。
劉兵研究員
解放軍總醫院第五醫學中心（原軍事醫學科學院附屬醫院）腫瘤學研究室主任。研究方向聚焦「基於造血幹細胞發育規律建立再生新策略」，陸續取得多個科學發現，包括：國際上首次在單細胞尺度實現造血幹細胞發育全程的深度解析；闡明LncRNA在造血幹細胞發生過程的重要作用；揭示小鼠胚胎頭部是造血幹細胞發育的新位點；闡明造血幹細胞起源的功能異質性。近五年承擔國家傑出青年科學基金、國家重點研發計劃等項目，入選國家科技部創新領軍人才、萬人計劃等，以通訊作者在Nature、Cell Stem Cell、Blood等雜誌發表多篇學術論文，其中3篇被F1000推薦。培養的博士研究生榮獲2016年度吳瑞獎（The Ray Wu Prize）。
原文鏈接：https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(18)30559-9
參考文獻
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3. Luo, M. et al. Long non-coding RNAs control hematopoietic stem cell function. Cell stem cell, 16, 426-438 (2015).
4. Zhou, F. et al. Tracing haematopoietic stem cell formation at single-cell resolution.Nature, 533, 487-492 (2016).
5. Zhou, J. et al. H19 lncRNA alters DNA methylation genome wide by regulating S-adenosylhomocysteine hydrolase. Nature Communications, 6, 10221 (2015).
6. Venkatraman, A. et al. Maternal imprinting at the H19–Igf2 locus maintains adult haematopoietic stem cell quiescence.Nature, 500(7462), 345 (2013).
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