國產新技術終於來啦！基因魔剪成了分子診斷的新幫手

　　來源：科學大院

　　「分子診斷」聽起來非常「高大上」，其實大家早已不陌生：

　　要獻血？血站采血之後要檢測乙肝（HBV）、丙肝（HCV）和艾滋病（HIV）等病毒。

　　要生娃？抽點血來產前篩查（地中海貧血、血友病、耳聾基因檢測等）和新生兒篩查。

　　想看有沒有患癌風險？來做個腫瘤早期篩查吧，看你是不是有腫瘤易感基因。

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　　這一切都離不開分子診斷技術。

圖片來源：視覺中國

　　核酸分子，是一切生命形式最基本的遺傳物質。分子診斷技術通過對核酸分子的快速準確鑒定，能夠提供各類疾病的患病風險、病因和基因型等信息，從而為疾病的預防、監控和治療提供相應依據。

　　目前最為成熟、應用最為廣泛的分子診斷技術是聚合酶鏈式反應技術（PCR技術）。但是，由於該技術操作複雜、儀器昂貴、還涉及多重變溫過程，使得該技術在現場和家庭檢測領域的應用中受到了極大限制。

　　中國科學院深圳先進技術研究院副研究員周文華博士等利用CRISPR系統效應蛋白Cas9在與靶核酸分子結合過程中獨特的構象變化，高效啟動針對靶核酸分子的指數倍擴增（簡稱CRISDA技術），可在1小時左右將極低濃度的特徵性靶核酸複製至足夠被檢測到的濃度，而且無需經過任何變溫過程。相關研究成果已發表在國際權威刊物《自然·通訊》 （Nature Communications）上，文章共同第一作者為周文華副研究員和胡麗研究助理，通訊作者是喻學鋒研究員 （Nat.Commun。 2018， 9， 5012）。相關技術也已申請專利保護。

研究成果以長文形式發表於國際權威刊物《自然·通訊》雜誌

　　PCR：循環變溫是我的短板

　　PCR技術是一種在體外擴增DNA分子的技術，通過在待擴增的DNA片段兩側設計兩條寡核苷酸引物，經過多重循環後，實現靶DNA分子的指數倍擴增。

PCR過程示意圖（圖片來源：http://www.baike.com/wiki/%E8%81%9A%E5%90%88%E9%85%B6%E9%93%BE%E5%BC%8F%E5%8F%8D%E5%BA%94）

　　然而，由於PCR的每個循環過程包括了高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個溫度不同的事件，對儀器的精確控溫要求極高。市面上的PCR熱循環儀價格普遍在數萬至數十萬元之間，若想要在家庭、社區或基層檢測機構中實現普遍性使用仍是一大難題。

　　為了克服PCR技術的缺點，一類不依賴變溫的檢測技術，即等溫擴增技術得到了廣泛關注。這些技術由於反應溫度單一，不受熱循環儀的制約，正逐漸在特定領域取代PCR。但是當前，等溫擴增技術在體系複雜程度、靈敏度、特異性和抗干擾能力等方面仍存在著缺陷。更重要的是，目前所有成熟的等溫擴增檢測技術的核心專利均掌握在國外公司手中。

　　因此，開發出一種性能優異、具有完全自主知識產權的核酸等溫擴增檢測新技術，對滿足我國分子診斷領域日益增長的需求、提高相關產業的國際競爭力意義重大。

　　基因魔剪變身「搜索引擎+雙鏈開關」

　　大名鼎鼎的CRISPR/Cas9系統被稱為「基因魔剪」，在基因調控和基因編輯等領域應用廣泛，該系統的效應蛋白（Cas9蛋白）能夠識別特定基因序列，並對識別靶點附近的 DNA 雙鏈進行剪切。

CRISPR/Cas9技術機理示意圖。一段與靶核酸序列互補的sgRNA（引導RNA）分子與CRISPR的效應蛋白Cas9形成Cas9-sgRNA複合體後，可在複雜條件下自主尋找靶核酸分子，並一步完成特異性結合與切割。（圖片來源：研究團隊）

　　早在2015年初，當世界上絕大多數課題組都將精力和資源投入到CRISPR基因治療領域時，該團隊就率先意識到CRISPR體系在分子診斷領域將有巨大的應用前景和優勢：該技術操作簡便、靈敏度高、抗干擾性強。「可以說，當時我們是在世界範圍內最早提出這一設想的課題組之一。」周文華說。

　　經過三年不斷的努力，第一代CRISDA技術已逐漸成熟。

　　在CRISDA反應中，Cas9蛋白就像一個具有主動搜尋功能的「開關」，在找到具有某一疾病或某一特徵相關的特定靶DNA序列後，能高效起始該靶核酸的指數倍「複製」過程。整個反應過程可在從室溫到45度的條件下高效進行，對溫度要求極低。

　　實驗過程中，Cas9-sgRNA複合體在複雜溶液條件下主動搜尋靶核酸分子並與之結合切割，切割後的靶DNA分子被解旋並暴露出單鏈區域，擴增引物進一步與該區域結合形成後續擴增反應的「開關」結構。這一結構在擴增酶類的作用下，起始靶核酸分子的指數倍鏈取代擴增反應。

CRISDA技術作用機理簡圖。（圖片來源：研究團隊）

　　「在實際應用領域，對特定序列的核酸進行檢測的難度在於如何對極低濃度的靶核酸分子進行特異性高效擴增。而對特異性擴增後的產物的檢測，目前市場已有多種成熟的手段，並不是技術難點。」周文華介紹說。

　　然而，課題組將CRISPR體系作為核酸等溫擴增反應的開關，並應用於分子診斷領域的研究尚屬首次。同時，CRISDA技術背後原理十分複雜，為了實現這一基因快檢技術，團隊在研發過程中也經歷了多重考驗。「可以說我們當時是在一個完全未知的領域探索，每個技術細節都是靠我們不斷的嘗試和優化來實現的。」 周文華提到。

　　CRISDA：四大優勢

　　目前，研究團隊已通過兩步反應，在90分鐘內，對極微量（20 μL）複雜溶液樣品中的個位拷貝數的靶核酸分子成功實現了等溫擴增檢測，如人基因組片段、乳腺癌致病風險相關的突變位點或轉基因大豆基因組等。CRISDA技術在這一極微量體積和極低濃度下的優異性能，可完全滿足目前分子診斷中，針對循環腫瘤DNA（ctDNA）和循環遊離胎兒DNA（cffDNA）等檢測的需求。

利用CRISDA技術對aM量級的靶分子進行單核苷酸多態性（SNP）擴增檢測。（a）不同細胞株基因組中rs3803662位點的測序驗證；（b）利用CRISDA技術對該SNP位點進行高靈敏度擴增檢測。（圖片來源：論文）

　　CRISDA技術在諸多方面均優於傳統PCR技術，

　　首先，在靈敏度方面，由於CRISDA技術與傳統PCR技術相比具有更優異的抗干擾性，其可在複雜背景條件下，對aM（10-18M）濃度的靶核酸分子進行高效擴增檢測。而在相同條件下，PCR技術由於抗干擾能力較差，無法實現有效擴增。

　　其次，在特異性方面，CRISDA技術無需優化即可實現對極低濃度的靶核酸分子進行單核苷酸多態性（SNP）檢測。而PCR技術要實現SNP檢測則需通過聯合測序、酶反應或者多重引物等條件來實現，其成本和複雜程度無法滿足快速分子診斷的需求。

　　第三，在普適性方面，在CRISDA檢測反應中，所需的擴增引物設計簡單，無需優化即可迅速實現對新位點的檢測反應體系開發。而PCR反應或其他等溫擴增反應則需經過大量優化。目前，課題組已利用該技術成功檢測出人基因組中乳腺癌相關的單核苷酸位點突變，並在野生型大豆中成功檢測出萬分之三的轉基因大豆。

　　第四，在操作難度方面，CRISDA技術無需依賴儀器，僅通過簡單操作，即可在90分鐘內即可完成從富集到擴增檢測的全部過程。且整個過程對溫度依賴極低。而傳統的PCR技術則需依賴多步繁瑣操作，過程耗時4小時，且對儀器控溫要求極高。

傳統PCR技術與CRISDA檢測技術對比（圖片來源：研究團隊）

　　此外， CRISDA技術可與一步法CRISPR靶向核酸富集技術完美結合，在進一步提升CRISDA檢測性能的基礎上，解決了核酸提取這一困擾分子診斷領域的技術痛點。例如，利用該一步法CRISPR靶向核酸富集技術，可實現對複雜樣品中的靶核酸分子特異性提取，可極大地縮短血篩檢測樣品前處理的難度和複雜程度。同時，這一技術也為未來CRISDA技術在基層和家庭推廣奠定了基礎。

　　未來：在家就能做診斷……

　　近期，周文華等提出的以該技術為背景的「基於CRISPR-Cas系統的核酸高敏快速等溫檢測技術」項目在中科院首屆「率先杯」未來技術創新大賽中，從近千個項目中脫穎而出，獲得最終決賽優勝獎。「你們的技術想法非常獨到，很好地利用了CRISPR技術的特點，並展現了該技術相比於傳統PCR技術的優勢。我相信這一技術未來在核酸分子檢測領域將有著非常重要的意義。」大賽評委點評中提到。

　　目前，團隊也正在積極和分子診斷行業的龍頭企業開展深入合作，將該技術應用於突發或新型傳染病的檢測，如新型流感，非洲豬瘟等。

　　未來，團隊計劃基於CRISDA技術，開發出名片大小的一次性微流控生物晶元，服務於遺傳病篩查、流行病診斷、食品安全和公共安全等領域，充分滿足從現場檢測到家庭檢測的市場需求。

　　「我們設想未來僅需極少量的生物樣本，利用CRISDA的生物晶元就能在家零門檻檢測老人或兒童患的是普通感冒還是新型病毒性流感。」周文華暢想道，「同時，CRISDA家庭檢測儀所獲得的結果將實時上傳到家庭所註冊的社康中心，家庭醫生將結合檢測結果和最近從社區到地區的流行病風險變化迅速給出最有效的治療方案。我們希望這一切都能在家庭完成，從而提高患者的診療效率，避免到醫院就診過程中的交叉感染，並減少三甲醫院的壓力，充分發揮基層社康中心的分級能力。」

CRISDA檢測系統原理（圖片來源：研究團隊）

　　該團隊的研究展示了基於CRISPR-Cas9的核酸等溫檢測技術在醫療診斷和食品安全領域巨大的應用前景，同時也為其他具有類似特性的系統或蛋白在應用上提供了新思路和方法。這一系列研究將有可能推動分子診斷技術和產品從目前的專業機構延伸至基層乃至家庭。

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