染色體異常檢測，揭開複發流產原因的神秘面紗

胚胎染色體異常顯著提高複發流產的風險。鑒於此，美國婦產科協會（ACOG）、英國皇家婦產科協會（RCOG）、美國生殖醫學學會（ASRM）三大權威機構一致倡導：複發流產有必要查明流產原因。

複發自然流產的定義

複發性自然流產（Recurrent Spontaneous Abortion，RSA）是指連續2次或2次以上發生在妊娠20周之前或胎兒體重＜500g的妊娠產物或胎兒丟失【1】。大約1%育齡女性經歷過RSA，且隨流產次數增加，複發風險增加【2-4】。RSA病因錯綜複雜，主要包括胚胎因素、遺傳、解剖、內分泌、感染、血栓前狀態、免疫、環境因素等。據報道，一半以上胚胎自然流產由染色體異常引起【5】。隨著染色體檢測技術的不斷發展，越來越多的研究開始從染色體水平深入探討疾病發生的原因。本文結合今年4月發表在Genetics in Medicine雜誌上的一篇文章就複發性流產相關染色體異常問題進行介紹。

胚胎染色體異常為RSA重要病因

偶發性自然流產可看做在配子形成及胚胎髮育過程中出現的隨機錯誤事件而導致的胚胎染色體異常引起的，屬於自然淘汰過程，再次妊娠的流產風險無明顯增加。但對於複發性流產，原因複雜。有研究表明，複發性流產的胚胎染色體異常率高於偶發性自然流產的。Sahoo T等【6】採用SNP晶元（Illumina CytoSNP-850K）的方法對7396例流產組織標本（其中83%為RSA）進行了檢測，發現其中53.7%（3975例）的樣本存在染色體異常，44.3%（3272例）的樣本未檢出染色體異常，還有2%（149）的樣本檢出了致病性未知（Variants of Unknown Significance，VOUS）的染色體拷貝數變異（Copy Number Variations，CNVs）。檢出的主要染色體異常包括以下幾種：

染色體數目異常

染色體數目異常分為染色體非整倍體（三體、單體）和多倍體，其中三體最常見，占染色體異常樣本的66.5%，其次為多倍體（14%）和單倍體（12.6%）。三體通常是母體減數分裂中染色體不分離導致的，常見為16、22、21、15、13 、18和14號染色體，在三體樣本中分別佔24%、14%、11%、11%、7%、4%、3%，其它染色體三體合佔26%；而單體流產中常染色單體比較少見，多為夫婦X染色體丟失而出現的X性染色體單體，佔比11.2%，發生的機制仍不清楚，僅推測這些染色體異常可能導致早期的自然流產；多倍體，如三倍體或四倍體，三倍體通常是由於雙精入卵或卵子在母體減數分裂過程中不分離並直接受精而導致的，佔比14%；四倍體可能是由於受精卵有絲分裂不分離導致，僅佔比0.04%。

染色體結構異常

胚胎染色體結構異常可受內外環境影響自發突變而成，或是由攜帶染色體結構異常的夫婦垂直遺傳。其中CNVs佔4.5%，性染色體異常佔比0.7%。

染色體其它異常

單親二倍體，是指遺傳物質來源於單親，胚胎常在發育過程中夭折。其中全基因組層面的單親二倍體佔1%，整條染色體或CNV層面的單親二倍體佔0.45%（其中50%同時有三體異常）。

排查胚胎染色體異常的重要性

雖然很多流產胚胎染色體異常具有偶發性，複發風險小，但部分流產胚胎染色體異常卻顯著提高複發流產的風險。鑒於此，美國婦產科協會（ACOG）、英國皇家婦產科協會（RCOG）、美國生殖醫學學會（ASRM）三大權威機構一致倡導：複發流產有必要查明流產原因【1, 7-8】。對於50%-60%的通過胚胎染色體異常檢測查明流產原因的孕婦，可以有效避免接下來的不必要的其他檢測和治療，大大節省醫療開支；而其他通過胚胎染色體異常檢測未發現染色體異常的孕婦，則可以將流產原因排查重點指向解剖、內分泌、感染、血栓前狀態、免疫、環境因素等。更重要的是，一些特定的胚胎染色體異常能給評估和諮詢複發流產風險以及活產多發先天畸形和/或神經認知障礙兒風險提供直接的有價值的信息。除此之外，胚胎染色體異常檢測帶來的心理上的幫助不容忽視。Bardos等【9】研究發現，許多經歷過流產的婦女感到內疚和明顯的被孤立。通過胚胎染色體異常檢測給夫婦一個明確的流產原因，能將懷孕期間的不良心理影響降到最低。

胚胎染色體異常檢測技術

核型分析

將待測的細胞的染色體按照固有的染色體形態特徵和規定，進行配對、編號和分組，並進行形態分析的過程。核型分析可以從宏觀上分析23對染色體一些可見(一般>10Mb)的染色體異常情況，但是對於小於10Mb的結構異常就無法發現。儘管準確度較高，但是技術本身操作過程較繁瑣，工作量大，且細胞培養存在母源污染和失敗風險（20%-40%），一次統計分析的細胞數一般不超過50個，無法避免人為誤差。

熒光原位雜交技術

熒光原位雜交技術（Fluorescent In Situ Hybridization，FISH）利用熒游標記的DNA探針，與分裂間期或中期細胞雜交，對染色體進行檢測。相對於傳統核型分析，FISH檢測周期短（約24小時），精度高（可達1Kb）。但是，該方法目前不能檢測全基因組的所有23對染色體，只能檢測其中的5-9對染色體。因此相對於染色體核型分析來說，雖然可以更精確和更精細地對基因進行定位分析，但失去了核型分析的宏觀性。因此，在臨床應用中，FISH往往與核型分析結合應用。

晶元技術

晶元技術（Array CGH或SNP Array ）， 一種基於晶元平台的全基因組DNA拷貝數變異分析技術。Array CGH是將待測樣本和對照正常樣本分別用不同顏色的熒光染料標記，和微陣列晶元進行雜交，通過比較染色體上熒光信號的顏色及相對強弱便可判斷染色體的拷貝數變化；SNP Array通過分析SNP的雜合性丟失或者雜合性異常快速檢測待測樣本的拷貝數變化。與熒光原位雜交技術（FISH）相比，晶元技術具有更高的解析度和靈敏度，全基因組覆蓋，一次能檢測23對染色體。不過覆蓋均一性不好，有的區域容易漏檢，檢測成本較高，價格昂貴，限制了其在臨床的廣泛應用。

高通量測序技術

高通量測序技術又稱下一代測序技術（Next-generation Sequencing Technology，NGS），能一次對幾百萬條DNA分子進行序列測定，實現高通量、高效率、高準確度、低運行成本。運用高通量測序技術檢測CNVs即CNV-Seq，可一次性檢測全部23對染色體的結構及數目異常，與晶元技術相比，覆蓋度更高更均勻，結果更精準，性價比更高。

科諾安全面排查胚胎染色體異常

科諾安染色體疾病檢測（以下簡稱科諾安）作為CNV-Seq的領先產品，早在2013年初，即與中南大學湘雅醫院合作，對收集的72例臨床樣本進行科諾安回顧性臨床研究，研究採用雙盲試驗設計，並將科諾安檢測結果與SNP 晶元結果進行比對。結果【10】顯示，科諾安和SNP 晶元對於已知致病CNVs都能達到100%的檢出，但在對於某些致病性未知的CNVs檢測上，科諾安則明顯優於SNP晶元。

科諾安目前在臨床已與全國400多家醫院聯合開展，流產物檢測已突破10000例，檢測結果統計顯示：有明確染色體異常的樣本佔52%，檢出致病性未知CNV的樣本佔10%，沒有染色體異常的樣本佔38%。與最新Sahoo T等【6】發表的高密度SNP晶元的科研結果相比，毫不遜色。同時與SNP晶元相比，科諾安還具有檢測成功率更高，全基因組覆蓋更均勻，能發現更多新的CNVs，性價比更高等諸多更適合於臨床大規模開展的優勢。

參考文獻

［1］Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine. Definitions of infertility and recurrent pregnancy loss：a committee opinion［J］. Fertil Steril，2013，99（1）：63.

［2］Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertil Steril 2012; 98:1103–1111.

［3］Ford HB, Schust DJ. Recurrent pregnancy loss: etiology, diagnosis, and therapy.

Rev Obstet Gynecol 2009; 2:76–83.

［4］Simpson JL, Juneau ERM. Pregnancy loss. In: Gabe SG, Nimbly JR, Simpson JL, eds. Obstetrics: Normal and Problem Pregnancies, 6th edn. Elsevier Saunders: Philadelphia, PA, 2012.

［5］Sugiura-Ogasawara M，Ozaki Y，Katano K，et al. Abnormal embryonic karyotype is the most frequent cause of recurrent miscarriage［J］.Hum Reprod，2012，27（8）：2297-2303.

［6］Sahoo T, Dzidic N, Strecker M N, et al. Comprehensive genetic analysis of pregnancy loss by chromosomal microarrays: outcomes, benefits, and challenges [J]. Genetics in Medicine, 2016.

［7］American College of Obstetricians and Gynecologists Committee on Genetics. Committee Opinion No. 581: the use of chromosomal microarray analysis in prenatal diagnosis. Obstet Gynecol 2013; 122:1374–1377.

［8］Regan L, Backos M, Rai R. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. RCOG Greentop Guideline No. 17. April 2010. https://www.rcog.org.uk/globalassets/documents/guidelines/gtg_17.pdf.

［9］Bardos J, Hercz D, Friedenthal J, Missmer SA, Williams Z. A national survey on public perceptions of miscarriage. Obstet Gynecol 2015;125:1313–1320.

［10］Liang D, Peng Y, et al. Copy number variation sequencing for comprehensive diagnosis of chromosome disease syndromes. J Mol Diagn.2014 Sep;16(5):519-26.

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