基因編輯最大隱患已被排除？中國科學家先於張鋒發布新技術，第三代工具或再迎專利之爭

知識 01-23

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V型CRISPR系統中的核心蛋白Cas12b（也被稱C2c1），在過去很難在人類細胞中完成基因編輯，因為Cas12b蛋白家族的最適反應溫度通常都比較高。張鋒今天發表在《自然·通訊》上的文章提到，一種通過改造的Cas12b蛋白可以在常溫，高效、高準確性地完成基因編輯。張鋒在文獻中描述到：這種BhCas12b比Cas9的編輯精準性更高。這是基於Cas9的第三代可用於人類細胞的基因編輯工具。

但是在一個多月前，來自中科院動物所的科學家已經發表論文，內容也同樣是基於改造Cas12b發明了新一代的基因編輯系統。這與張鋒的新研究不謀而合，那麼二者之間會不會掀起新一場CRISPR技術專利之爭呢？

撰文丨楊心舟

這種頗具潛力的Cas蛋白被稱為BhCas12b，其是從外村尚芽孢桿（Bacillus hisashii）中提取出來，而並非常規的耐酸嗜熱菌。BhCas12b能在37℃條件下保持酶活性，但會造成非靶向性DNA切除，編輯效率並不高。張鋒通過針對BhCas12b的特定突變，將其進行了改造之後，其展現出了強大的基因編輯效率。在人類細胞系以及人體提取的原代T細胞中都在展現出了優秀的編輯能力。

既然是第三代工具，為什麼叫V型CRISPR系統呢？我們首先需要了解的是第三代是指第三種可以用於人類細胞的基因編輯工具，而V型指的是Cas蛋白家族的亞型。這是兩種不同的概念。

在CRISPR系統中，基本可以分為2類

第一大類：

包括I型（Cas3）、III型（Cas10）、IV型（Csf1）

這一類系統是由多個蛋白亞基組成的效應子模塊，在細菌和古細菌中已經鑒定的CRISPR/Cas系統中佔到約90%，可以靶向RNA或者DNA。從下圖中可以看到除了III型的CRISPR系統都需要依託於模塊蛋白Cas1以及Cas2，同時還包括輔助蛋白質，如執行逆轉錄酶功能的Cas4和結構域蛋白的CARF。

第二大類：

這類是我們比較熟知的CRISPR系統，經過改造已經在2013年實現了真核生物基因組的編輯。包括II型（Cas9）以及張鋒在2015年通過序列對比和系統分析發現的V型（Cas12），V型中已經得到開發的V-A型又稱Cas12a或Cpf1。而今天這篇文獻所說第三代也就是Cas12b或C2c1。

這一類效應子模塊只包含單個蛋白，但這個蛋白較大且包含多個結構域。其佔到CRISPR系統中基因座的10%左右，已經在不同的細菌種屬發現，但是古細菌中難覓蹤跡。II型和V-B型包括tracRNA的組件（用於反式激活CRISPR RNA）。

今天發表的Cas12b與張鋒團隊此前發表的Cas9以及Cas12a比較如下：

Cas9系統：Cas9蛋白雙鏈引導RNA CRISPR RNA（crRNA） tracRNA;包含HNH和RuvC結構域

Cas12a系統：Cas12a蛋白單鏈引導RNA CRISPR RNA；包含RuvC結構域

Cas12b系統：Cas12b蛋白雙鏈引導RNA CRISPR RNA tracRNA；包含RuvC結構域

但Cas12b有一個絕對優於前面兩者的特點，那就是蛋白小。在基因編輯實驗中，通常都需要藉助病毒載體將CRISPR系統轉染到細胞中，蛋白表達基因越小就意味著越容易進入細胞。此前科學界已經在嗜酸耐熱菌中發現了AacCas12b，但它的最適酶活溫度在48℃左右，顯然這並不適合在37℃的哺乳動物體內進行工作。

因此張鋒選擇了重新尋找更加合適的Cas12b。其通過資料庫測序比對分析發現了27種包含V-B結構域的Cas12b，他們發現V-B型系統在各種類型的細菌中都有，暗示它的傳遞性會更廣。在多種篩除手段後，實驗結果顯示AKCas12b和BhCas12b在37℃能表現出很強的酶切活性。但實際操作中，將兩個蛋白導入細胞後發現兩者的敲除效率都低於1%。張鋒通過改變tracRNA和crRNA的聯結架構後，發現BhCas12b的酶活能提升至原來的30倍，而AKCas12b幾乎沒有變化。至此基本可以確定BhCas12b是他們想要的最優蛋白。

但是在這種活性下，精準度成了問題，實驗結果顯示在37℃時BhCas12b傾向於去切割非目的片段的DNA，也就是常說的脫靶效應。張鋒認為這是BhCas12b的Ruvc端出了問題，讓靶標DNA難以結合定位。因此他們決定對蛋白結構進行改造，他們一共分別對176種蛋白進行了突變，並且分析了其切割效應，其中K846R和S893R的改變會明顯提升切割的活性和準確性。他們推斷，這兩個區域分布的精氨酸鏈對核酸骨架交互起重要作用，因此這種突變提升了BhCas12b與目標DNA的親和度，促進了DNA切割。

此外，像BhCas12b這種酶活溫度相對於嗜熱菌里的Cas12b已經屬於適冷酶了，這種酶的表面會布滿許多甘氨酸，從而可以增加其酶活和延展性。張鋒也同樣檢測了這些甘氨酸突變的效果，結果顯示，在66中表面甘氨酸中，E837G的突變可以將酶活升至兩倍。

最後他們將上述的三個突變合併到了一個Cas蛋白中，稱其為BhCas12b v4，這種Cas蛋白可以在37℃下完成精準高效的實驗。相較於第一代Cas9和第二代Cas12a，其脫靶率極大降低，在張鋒進行編輯的細胞中，第三代編輯工具的脫靶率為0，而Cas9在9個實驗中有6個出現了脫靶。

張鋒發表的第三代基因編輯工具可以說是非常完美的，其擁有與Cas9媲美的DNA酶切活性，並且靶標準確性遠超Cas9。只是，已經有人先其一步。中科院動物所在2018年12月就發表論文表示找到並構建了CRISPR/Cas12b編輯工具。（下圖藍條論文）

從標題來看，兩者幾乎就是做的一件事情——改造後的Cas12b可以成為新一代基因編輯工具。當然Cas12b蛋白的細菌來源以及改造工程並不一樣。中科院動物所李偉和周琪研究員同樣發現許多嗜酸耐熱菌中的Cas12b酶活溫度在37℃以上，但是他們找到了Alicyclobacillus acidiphilus 中的AaCas12b，其酶活反應溫度異常廣，在31℃-59℃之間都能保持高效酶切反應。他們所做的改造工程是將crRNA和tracRNA整合設計成單獨莖環，與雙鏈RNA工作，此舉也能極大提高酶活效率。經過改造後其同樣能實現張鋒團隊高效、高準確性的Cas12b結果。

說到CRISPR必定少不了專利之爭，Jennifer Doudna與張鋒曾就CRISPR/Cas9技術爭奪了近數年，Jennifer先於張鋒提交專利，其認為申請專利應遵循「先遞交者獲得專利」的最新規則。而張鋒則認為申請呈遞時的舊規則為「先發明者獲得專利」，Jennifer只提供了思路而未發明出來，專利應屬於自己。他在2013年申請了加急專利，2014年獲得批准，此後二者就開展了專利大戰。

直到2017年2月15日，美國專利及商標局終於做出裁決——三名法官一致認為張鋒所在的Broad研究所申請的CRISPR/Cas9基因編輯專利，與加州大學伯克利分校Jennifer的CRISPR/Cas9發現，並不存在衝突（「no interference in fact」）。換句話說，兩家申請的專利涵蓋並不重複，因此張鋒與Broad研究所繼續保留在2014年獲批的CRISPR/Cas9專利權。

那麼這個第三代工具究竟會不會又引起紛爭呢？就此相關問題《環球科學》採訪了武漢科技局的相關人員。根據對話，我們了解到專利申請本身周期較長，通常一個專利申請呈遞上去後正常情況下需要20個月才能審批下來，而動物所申請國際專利的時間跨度可能就更大。在專利發表之前網路搜索不到申請內容，因此張鋒有沒有申請專利，目前處於專利申請哪個階段是不可知的。

此外，文獻發表時間的早晚與專利申請之間沒有必然聯繫，只要專利申請提交日期在文章發表前即是有效的。也就是說現在雖然中科院動物所的文獻發表較早，但是只要張鋒的專利先於其提交上去並被批准，仍然能搶先拿到專利。

況且，從Jennifer當年與張鋒的專利之爭看來，專利的界限定位可以非常小，也就是說只要創新度足夠，是完全可以成為兩個「並不存在衝突」的專利申請。從目前兩篇文獻來看，二者的發現過程，改造過程，應用方法是完全不一樣的，因此成為互不衝突的專利機會很大。在2018年，李偉和周琪也基於張鋒2015年釋出的第二代CRISPR/Cas12a，創新後發表了相關專利。