2019年1月CRISPR/Cas最新研究進展
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谷 君 說
Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱，最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
2019年1月CRISPR/Cas最新研究進展
文/towersimper
基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短迴文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。
2018年11月26日，中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經過基因編輯的嬰兒---一對雙胞胎女性嬰兒---在11月出生。他利用一種強大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對這對雙胞胎的一個基因進行修改，使得她們出生後就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫艾滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內外網站上迅速發酵，引發千層浪。有部分科學家支持賀建奎的研究，但是更多的是質疑，甚至是譴責。
過去的1月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下生物谷報道的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。
1.我國科學家成功克隆出5隻基因編輯猴子作為生物節律紊亂動物模型
doi:10.1093/nsr/nwz002; doi:10.1093/nsr/nwz003
2019年1月24日，在兩篇發表在National Science Review期刊上的論文中，中國研究人員克隆出5隻基因編輯獼猴。這兩篇論文的標題分別為「BMAL1 knockout macaque monkeys display reduced sleep and psychiatric disorders」和「Cloning of a Gene-edited macaque monkey by somatic cell nuclear transfer」。
這些基因編輯獼猴通過體細胞核移植方法克隆出來。在大約一年前，這種方法被用來克隆出世界上第一隻靈長類動物（也是獼猴）。但是，在這兩篇新的論文中，這些研究人員首先利用CRISPR-Cas9對這些猴子的基因組進行編輯，具體而言就是敲除在晝夜節律調節中起著重要作用的基因BMAL1，讓它們出現睡眠障礙的癥狀。
根據中國科學院神經科學研究所非人靈長類動物研究平台主任孫強（Sun Qiang）在一份新聞稿中的說法，這些研究人員隨後挑選出發生「正確的基因編輯和具有最嚴重的疾病表型」的猴子進行克隆。
這些研究人員在這些克隆獼猴中觀察到的疾病跡象包括失眠和血液激素的變化，以及焦慮、抑鬱和「精神分裂症樣（schizophrenia-like）」行為的增加。
相關研究結果於2019年1月23日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Super-Mendelian inheritance mediated by CRISPR–Cas9 in the female mouse germline」。
根據論文通訊作者、加州大學聖地亞哥分校進化發育生物學家Kimberly Cooper的說法，啟動這個研究項目的原因在於她和她的團隊想要能夠複製其他物種的遺傳變化，這樣他們就能夠理解這些變化如何導致特定性狀。
但是，利用傳統的小鼠遺傳學，將多個轉基因組合在一起並且讓小鼠中每個轉基因的兩個等位基因保持純合是很棘手的。比如，在兩隻小鼠中，讓每隻小鼠攜帶相同的三個基因的突變拷貝需要將近150個後代才有90%的機會讓它們中的一個後代是純合的三重突變體。
3.基因編輯大牛張鋒新力作！發現第三種CRISPR-Cas系統，顯著降低脫靶效應
來自原核生物CRISPR/Cas系統的酶已被用作可編程的和高度特異性的基因組編輯工具。目前的基因組編輯技術集中在II型CRISPR-Cas系統上，該系統含有單個用於DNA切割的蛋白效應核酸酶。
然而，到目前為止，僅有兩個II型核酸酶家族用於人細胞中的基因組編輯：Cas9，即一種由兩個嚮導RNA（gRNA）引導的核酸酶，含有兩個核酸酶結構域：HNH和RuvC，其中這兩個gRNA為CRISPR RNA（crRNA）和tracrRNA；Cas12a，即一種由單個gRNA引導的核酸酶，含有單個結構域：RuvC，其中這單個gRNA為crRNA。
在一項新的研究中，來自美國布羅德研究所的張鋒（Feng Zhang）及其團隊著重關注第三種II型蛋白效應核酸酶：Cas12b，即一種由兩個gRNA引導的核酸酶，含有單個結構域：RuvC，其中這兩個gRNA為crRNA和tracrRNA。
儘管Cas12b蛋白通常比Cas9和Cas12a小，因而從通過病毒載體進行細胞內遞送的觀點來看具有吸引力，但是得到最好描述的來自嗜酸耐熱菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）的Cas12b核酸酶（AacCas12b）在48°C時表現出最佳的DNA切割活性，這阻止它在哺乳動物細胞中的應用。
張鋒團隊試圖鑑定出在較低溫度下有活性的Cas12b家族成員，這樣就可用於人類基因組編輯。相關研究結果於2019年1月22日發表在Nature Communications期刊上，論文標題為「Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing」。
鑒於強效的基因組編輯工具應當在一系列靶標上是高效的和特異性的，張鋒團隊在針對293T細胞中的5個基因的56個靶位點上測試了BhCas12b v4突變體，結果觀察到強效的DNA切割。接著，他們通過電穿孔技術將BhCas12b v4-sgRNA複合物遞送到人CD4 T細胞中。在3個測試的靶位點上，這些複合物表現出的indel發生率為32%～49%。這些數據表明BhCas12b v4突變體在多種基因組編輯環境下（包括一種在治療上有重大意義的人細胞類型）可作為一種有效的可編程的核酸酶。
最終，張鋒團隊試圖確定BhCas12b在人細胞中的全基因組靶向特異性。他們選擇了9個在不同Cas核酸酶之間表現出相當的indel活性的靶位點，並進行了Guide-Seq分析。針對BhCas12b v4突變體或AsCas12a，他們並沒有檢測到任何脫靶位點的存在，然而來自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpCas9）在其中的6個靶位點上表現出顯著的脫靶切割。
在14個非匹配性的位點上開展的進一步Guide-Seq實驗表明BhCas12b v4突變體僅在2個位點上檢測到脫靶切割。與這些發現相一致的是，當gRNA和靶DNA之間的位點1～20上發生雙位點錯配時，他們觀察到有限的indel活性，而且對單個位點錯配表現出較低的耐受性。這些結果對在人細胞中觀察到的較低的脫靶活性提供了一種分子水平上的解釋。
4.eLife：Crispr基因編輯技術有助於治療寄生蟲感染
doi:10.7554/eLife.41337; doi:10.7554/eLife.41463
喬治華盛頓大學（GW）的研究人員以及泰國，澳大利亞，英國和荷蘭等研究所的同事們首次成功地使用基因編輯工具CRISPR / Cas9來限制血吸蟲病和肝吸蟲感染的影響。他們的研究結果發表在今天發表在eLife期刊上的兩篇論文中。
「在我們的動物模型中，使用CRISPR / Cas9"敲除"的基因導致感染癥狀顯著減少，」作者說道 「我們的研究還表明，這種革命性的新生物醫學程序-CRISPR / Cas9-可用於研究蠕蟲寄生蟲，這是熱帶氣候中的主要公共衛生問題。」
血吸蟲病可引起嚴重的健康問題，包括肝臟和腎臟受損，不育和膀胱癌。淡水蠕蟲曼氏血吸蟲通過鑽入皮膚進入人體;一旦進入血液，它們會移動到各種器官，在那裡它們迅速開始繁殖。他們的卵釋放出幾種分子，包括一種叫做omega-1核糖核酸酶的蛋白質，可以破壞周圍的組織。 Brindley和他的研究團隊使用CRISPR / Cas9「敲除」了這種蛋白質，並發現它大大降低了這種疾病的影響。
肝吸蟲O. viverrini感染可引起一種稱為膽管癌的肝癌。這種寄生蟲通過攝入未經烹煮或未煮熟的魚傳播。一旦進入體內，寄生蟲就會沉澱在人體肝臟中並分泌一種叫做顆粒蛋白的蛋白質，這種蛋白質可能會促使肝細胞繁殖，從而增加患癌症的風險。 Brindley和他的研究團隊使用CRISPR / Cas9去除編碼顆粒體的基因，併產生只能產生極少量蛋白質的寄生蟲，導致肝吸蟲感染的癥狀明顯減輕。
5.Cell：利用CRISPR-Cas9鑒定出新的輔助性T細胞調節基因
doi:10.1016/j.cell.2018.11.044
T細胞是免疫系統中的關鍵細胞。在一項新的研究中，來自英國威康基金會桑格研究所和芬蘭圖爾庫大學的研究人員構建出首個逆轉錄病毒CRISPR-Cas9基因編輯文庫來探究對小鼠T細胞的調節。他們繪製出控制輔助性T細胞（T helper cell, Th）的最為重要的基因的圖譜，並鑒定出幾個新的調節基因。基於此，他們揭示了很多不同的基因參與Th細胞激活和發育的複雜控制機制。理解是什麼調節T細胞發育可能有助於發現新的藥物來抵抗免疫系統過度活躍導致的過敏和類風濕性關節炎等自身免疫疾病。
此外，這些發現也可能有助於科學家們開發新的療法來激活免疫系統，從而抵抗感染或攻擊腫瘤細胞。相關研究結果於2019年1月10日在線發表在Cell期刊上，論文標題為「Genome-wide CRISPR Screens in T Helper Cells Reveal Pervasive Crosstalk between Activation and Differentiation」。
免疫系統保護身體免受感染和腫瘤的侵害。2型輔助性T細胞（T helper type 2, Th2）是免疫系統中的關鍵組成部分，它們釋放特定的化學物質來告訴身體殺死入侵者。當檢測到入侵者時，Th2細胞被激活。它們隨後需要沿著正確的途徑進行發育以便最好地協助清除特定的感染，這一過程稱為分化。然而，仍然不清楚的是究竟是什麼信號激活這些細胞或告訴它們如何發育以及釋放哪些化學信號。
為了研究這一點，這些研究人員構建出一個新的由8.8萬個嚮導RNA（gRNA）組成的全基因組CRISPR文庫。這些gRNA讓他們能夠關閉來自小鼠Th2細胞的2萬個基因中的每一個。在模擬體外培養的Th2細胞受到感染後，他們研究了關閉基因組中的每個基因如何影響它們的激活或分化。他們發現了許多參與調節Th2細胞發育的不同基因，並確定了一個基因調控網路。
6.Cell：給Cas9一個開啟開關，從而更好地控制CRISPR基因編輯
doi:10.1016/j.cell.2018.11.052
在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校的研究人員利用一種稱為循環排列（circular permutation）的技術，構建出一套稱為Cas9-CP的新型Cas9變體，這將簡化Cas9融合蛋白的設計，使得它們能夠用於除了簡單的DNA切割之外的多種應用，比如鹼基編輯和表觀遺傳修飾。相關研究結果發表在2019年1月10日的Cell期刊上，論文標題為「CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification」。
通過這個相同的過程，這些研究人員將「永遠開啟（always-on）」的Cas9分子轉變為可激活的開關。這些開關保持在「關閉」位置，直到它們被蛋白酶激活。由此產生的蛋白酶感應的Cas9（protease-sensing Cas9, ProCas9）能夠減少脫靶效應並實現分子感應，以及組織或器官特異性的基因組編輯。他們證實ProCas9可用於檢測病毒蛋白酶，從而潛在地用作一種能夠引發免疫反應的病原體感應系統。
Savage和他的團隊使用循環排列來重新設計Cas9的分子序列，因而更好地控制它的活性並為融合蛋白構建更優化的DNA結合支架。這種Cas9重新連接方法涉及將這種蛋白的末端（即它的氨基端和羧基端）與肽接頭（peptide linker）連接，同時在不同的位置上分割它的序列，從而產生新的相鄰的氨基端和羧基端。
這些研究人員發現Cas9對循環排列具有很強的延展性。這種蛋白的多個區域具有熱點，這些熱點可在多個位置上打開，從而產生多樣性的Cas9-CP，所產生的Cas9-CP可用作高級融合蛋白的支架。目前，Cas9的氨基端和羧基端是固定的，並且它們並不適合放置用於結合DNA的融合蛋白。相比之下，這些新的蛋白支架的末端更靠近這種蛋白的DNA相互作用界面，並且經優化後可高效地構建融合蛋白。
這些研究人員接下來通過設計肽接頭來產生ProCas9，並且這種肽接頭足夠短以便將這種蛋白限制在沒有活性的狀態，隨後引入可利用匹配的病毒蛋白酶加以切割的序列。此後，這些ProCas9經調整後可作為利他的能夠檢測病原體並對它們作出反應的防禦系統。當通過切割這種肽接頭激活這些ProCas9時，它們產生大量的DNA損傷並殺死受感染的細胞。
7.Nat Microbiol：基因編輯技術可以設計新型抗生素
doi:10.1038/s41564-018-0327-z
在最近一項研究中，威斯康星大學麥迪遜分校和加利福尼亞大學舊金山分校的的研究人員利用基因編輯工具CRISPR來研究特定抗生素靶向的基因，尋找如何改善現有抗生素或開發新抗生素的線索。
研究人員將Mobile-CRISPRi從常見的實驗室菌株轉移到不同的細菌中，甚至包括一些研究不多的微生物。這種易於轉移的特性使得該技術成為科學家研究任何導致疾病的有效手段。
Peters與Carol Gross，Oren Rosenberg以及加州大學舊金山分校和其他機構的其他同事一起設計和測試了Mobile-CRISPRi。該系統減少了靶基因介導的蛋白質的產生，使研究人員能夠確定抗生素如何抑制病原體的生長。相關成果於1月7日在《Nature Microbiology》雜誌上發表。作者們使用被稱為CRISPRi的一種缺陷型CRISPR，它只是能夠結合在DNA上，但無法切割DNA。這進一步阻止其他蛋白質進入並啟動特定基因的表達。
8.JCI insight：CRISPR-CAS9 基因編輯技術用於治療肌營養不良症
doi:10.1172/jci.insight.124297
CRISPR的基因編輯技術是治療遺傳性疾病的革命性方法。但是，該工具尚未用於有效治療長期慢性病。由密蘇里大學醫學院的Dongsheng Duan博士領導的一個研究小組已經確定並克服了CRISPR基因編輯的障礙，這可能為使用該技術進行持續治療奠定基礎。
CRISPR基因編輯的靈感來自於身體抵禦病毒的天然防禦能力。該技術使研究人員能夠通過切除和替換基因組中的突變來改變DNA序列，該突變有可能治療各種遺傳疾病和病症。 Duan和他在美國國立衛生研究院和杜克大學推進轉化科學國家中心MU的合作者正在研究如何利用CRISPR治療Duchenne肌營養不良症（DMD）。
Duan的實驗室使用CRISPR靜脈內治療6周齡DMD小鼠。他們最初採用了許多研究人員廣泛使用的策略。在該方法中，施用相似量的Cas9和gRNA。雖然直接注入肌肉時效果很好，但當團隊試圖在身體的所有肌肉中實現長期矯正時，這種策略產生了不良後果。他們發現，骨骼肌中沒有肌營養不良蛋白的恢復，心臟中的肌營養不良蛋白恢復很低 - 治療無法阻止疾病進展。
9.Mol Cell：科學家破解出新型CRISPR代碼 有望更加精準地進行人類基因組編輯
doi:10.1016/j.molcel.2018.11.031
近日，一項刊登在國際雜誌Molecular Cell上的研究報告中，來自Francis Crick研究所的科學家們通過研究發現了一組簡單的規則或能決定人類細胞中CRISPR/Cas9基因編輯的精準性，相關研究結果或能幫助科學家們改善實驗室和臨床中基因編輯技術的效率和安全性。
儘管如今科學界已經廣泛使用CRISPR系統了，但該技術的合理應用常常因為基因編輯結果的不可預測而受到重重障礙，基因編輯常常會帶來靶向位點DNA區域的隨機剔除或插入。
通過檢測並分析CRISPR基因編輯技術對人類細胞450個基因的1491個靶向作用位點的作用效應，研究人員發現，基於簡單的規則就能夠有效預測基因編輯所帶來的後果，這些規則主要依賴於導向RNA—Cas9所識別的特定基因組區域中的遺傳元件。這項研究中，研究者發現，特定基因編輯的結果常常取決於RNA導向的第四個「字母元件」，其更靠近切割位點。
如果遺傳元件是A或T，那麼這將會是一個非常精準的基因插入，如果是C的話就會導致相對精準的剔除，而G的話則會造成多種不精準的剔除作用。因此，在基因編輯過程中，簡單地避免含有鹼基G的位點或許能夠更加準確地預測基因編輯所產生的效果。
研究者Anob Chakrabarti指出，我們通過分析發現，決定CRISPR人類基因組編輯結果的規則實際上非常簡單，在設計導向RNA時要記住這些規則，這樣我們就能最大化的獲得特定基因編輯的理想效果，這在臨床中尤為重要。
同時研究者還闡明了開啟或關閉靶向DNA如何影響基因編輯的效果，而加入促進DNA打開的化合物就能夠促進Cas9搜尋基因組，從而提高編輯效率。
研究者表示，不管來源的組織如何（其會影響特定基因DNA開啟的程度），靶向作用關鍵位置中含有鹼基A或T的區域能夠表現出常見的編輯效果，也就是說，如果我們能夠仔細選擇靶向DNA的話，我們就能夠在不同組織中觀察到相同的效應。
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※Nature：科學家發現新型的CRISPR基因編輯工具：CasX
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