停！新型脫靶檢測技術為基因編輯踩下「安全剎車」

侯樹文 科技日報記者 王春

新一代基因編輯工具CRISPR/Cas9因其高效性和特異性而備受世人期待。然而，如果將基於CRISPR/Cas9及其衍生工具用於臨床，其脫靶效應可能會引起包括癌症在內的很多副作用。

近日，中國科學院神經科學研究所（中科院腦科學與智能技術卓越創新中心）、上海腦科學與類腦研究中心、上海營養與健康研究所隸屬的計算生物學研究所（中國科學院-馬普學會計算生物學夥伴研究所），斯坦福大學遺傳學系，中國農業科學院深圳農業基因組學研究所等在內的研究機構合作建立了一種被命名為GOTI的新型脫靶檢測技術，並使用該技術發現CRISPR/Cas9衍生技術BE3單鹼基編輯會產生大量脫靶突變，證實了以BE3為代表的部分基因編輯技術存在無法預測的脫靶風險。

這一發現使得人們對原本認為「特別安全、幾乎不會有脫靶」 的單鹼基突變技術進行重新審視。該研究結果於3月1日發表在世界頂級學術期刊《科學》上。

中國科學院科技攝影聯盟拍攝

中國科學院神經科學研究所靈長類疾病模型研究組組長、研究員楊輝表示，該研究建立了一種在精度、廣度和準確性上遠超越之前的基因編輯脫靶檢測技術，有望由此開發精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具。

「只有更安全的檢測方法才有更安全的基因編輯技術，我們的工作有助於儘快制定行業標準，讓這個領域有序健康地發展下去。未來可以基於我們的新技術制定行業標準，凡是要進入臨床的基因編輯技術必須經過我們這套系統的檢驗才能證明其安全性。」楊輝說。

基因編輯突飛猛進

需要精準靈敏的安全檢測技術

精準靈敏的脫靶檢測技術為快速行駛的基因編輯技術踩下了「安全剎車」。在20世紀80年代始，基因編輯技術開始不斷發展。而在CRISPR基因編輯技術橫空出世之後，基因編輯技術有了突飛猛進的發展。生物技術和製藥行業越來越多地參與基因治療，顯示了該領域的成熟，並且有必要加速這些治療手段的交付。

CRISPR/Cas9是廣泛關注的新一代基因編輯工具，自從2012年被發明以來，它一直以其高效性和特異性備受世人的期待，學術界普遍認為基於CRISPR/Cas9及其衍生工具的臨床技術將為人類的健康做出巨大貢獻。然而值得注意的是，CRISPR/Cas9從問世以來，其脫靶風險一直備受關注，如果將CRISPR/Cas9及其衍生工具用於臨床的話，脫靶效應可能會引起包括癌症在內的很多種副作用。

在此之前，人們推出過多種檢測脫靶的方案。以前的方法或者依賴於計算機軟體預測，或者依賴於高通量測序檢測DSB產生，還有體外檢測的方法。這些方法都存在一些局限性，不能高靈敏性檢測到脫靶突變，尤其是單核苷酸突變。

因此關於CRISPR/Cas9及其衍生工具的真實脫靶率一直存在爭議。因此一種能夠突破之前限制的脫靶檢測技術，將會成為CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最終走上臨床的關鍵。人們迫切希望可以找到一種既能夠不依賴於脫靶位點預測，又能有足夠信噪比的精密脫靶檢測手段。

GOTI有助於改良單鹼基編輯技術

為了實現以上目標，楊輝研究組與合作者建立了一種名叫「GOTI」的脫靶檢測技術。這項研究的精妙之處是利用小鼠胚胎做實驗。研究者在小鼠受精卵分裂到二細胞期的時候，編輯一個卵裂球，並使用紅色熒光蛋白將其標記。小鼠胚胎髮育到14.5天時，將整個小鼠胚胎消化成為單細胞，利用流式細胞分選技術基於紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細胞和沒有基因編輯細胞，再進行全基因組測序比較兩組差異。這樣就避免了單細胞體外擴增帶來的噪音問題。而且由於實驗組和對照組來自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細胞的基因組，其中的差異基本就可以認為是基因編輯工具造成的。

藉助於GOTI系統，團隊成員先是檢測了最經典的CRISPR/Cas9系統。結果發現，設計良好的CRISPR/Cas9並沒有明顯的脫靶效應，結束了之前對於CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。然而團隊還檢測了另一個同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術BE3，這個系統可以精確引入點突變，在之前的研究中從未發現過有明顯的脫靶問題。然而在GOTI的檢測下發現，BE3存在非常嚴重的脫靶，而且這些脫靶大多出現在傳統脫靶預測認為不太可能出現脫靶的位點，因此之前方法一直沒有發現其脫靶問題。

團隊分析後認為，這些脫靶位點有部分出現在抑癌基因上，因此經典版本的BE3有著很大的隱患，目前不適合作為臨床技術。研究團隊的這些重要發現，證實了以BE3為代表的部分基因編輯技術存在無法預測的脫靶風險，讓世人重新審視了這些新興技術的風險。

檢測出單鹼基編輯技術有問題，是不是應該放棄對該技術的研究？答案是否定的。研究表明現有BE3等單鹼基突變存在脫靶問題。但是很多人的遺傳病是單鹼基突變導致的。所以單鹼基突變技術本身仍然存在巨大的價值。

有數據表明，全球有7000種罕見病，其中80%是單基因遺傳病，50%發生在兒童時期。楊輝表示，接下來我們要做的主要是兩件事，一個是進一步檢測，看看它除了會導致異常基因突變以外還有沒有別的問題。然後在此基礎上，設法改進這個系統，建立一種不會脫靶，也沒有其他風險的單鹼基突變技術。

來源：科技日報 文中圖片均由本文作者提供

編輯：朱麗

審核：管晶晶

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