衣原體誘導、打開宿主免疫「防火牆」

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ctr）是一系列傳染病的病原體，與子宮頸癌和卵巢癌直接或間接相關，它可以作為人乳頭瘤病毒HPV感染的輔助因子，與宿主之間具有非常複雜的相互作用關係。上皮細胞間緊密相連，它們是一道嚴密的防線。間質細胞與上皮細胞相鄰，不同的是，它們組織鬆散，缺乏細胞連接和細胞極性。上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT） 通俗地理解為上皮到間質細胞的轉化，它賦予細胞轉移和侵襲的能力。

上皮間質轉化（EMT）

2019年1月，來自德國馬克斯普朗克感染生物學研究所的研究人員在國際專業學術期刊Cell Reports雜誌上發表了一篇運用磷酸化修飾組學和轉錄組學揭示Ctr如何誘導宿主細胞發生上皮間質轉化，從而打開免疫「防火牆」的文章。

這篇研究不僅鑒定到很多之前未知的Ctr磷酸化蛋白和受Ctr調控的宿主磷酸化蛋白，全面的展示了宿主細胞總成分及核成分中Ctr應答性激酶網路。此外還發現了包括ETS2抑制因子和原癌轉錄因子（TFs）在內的TFs在Ctr感染過程中發生磷酸化修飾，通過調控細胞運動與侵襲相關基因的轉錄誘導發生上皮間質轉化，為Ctr致病過程以及其他人類生殖道感染提供新的見解。

衣原體誘導宿主細胞的上皮-間充質轉化

組學思路

為了研究Ctr誘導產生的細胞信號通路，研究人員首先分別對三類樣本（感染Ctr的細胞，未感染Ctr的細胞、兩者的細胞混合物）的胞漿蛋白與核蛋白（樣本策略）開展了磷酸化修飾WB實驗。接著，在WB預實驗結果的基礎上，研究人員聯合細胞同位素標記法（SILAC），磷酸化修飾肽段富集法及質譜檢測的方法（質譜策略）對磷酸化修飾位點的差異變化進行定量研究。

研究精讀

1.Ctr感染宿主的全蛋白磷酸化修飾組學研究

通過磷酸化WB實驗，研究人員發現在Ctr急性感染與持續性感染的宿主細胞中磷酸化修飾水平普遍發生變化，同時質譜檢測結果表明，從細胞與細胞核中共鑒定到位於4564個蛋白上的17917個特異性磷酸化位點， 有4251個蛋白上的12863個磷酸化位點具有高可信度，其中位於1252個蛋白上的2327個磷酸化位點在Ctr感染後具有顯著差異變化。在總細胞提取物中，經Ctr感染後有1436個高可信度磷酸化位點的修飾表達水平顯著受到調控，上調957個位點，下調479個位點。在細胞核中，1383個磷酸化位點的修飾水平在Ctr感染後發生顯著改變，上調597個位點，下調786個位點。

Ctr感染宿主的全蛋白磷酸化修飾組學研究

2.Ctr誘導的激酶調控特徵

Ctr調控磷酸化蛋白的通路過表達分析揭示，Ctr調控信號通路涉及廣泛的分子和細胞功能。Ctr感染的總細胞提取物中的上調磷酸化蛋白顯著富集的前五位信號通路，包括有小GTP酶介導的信號轉導調控、細胞凋亡、應激活化蛋白激酶信號通路和JNK/MAPKKK級聯。此外，總細胞提取物和細胞核中的上調磷酸化蛋白都參與基因表達和轉錄調控，增殖以及核苷酸代謝。而下調的磷酸化蛋白主要參與的通路與細胞骨架組構，蛋白複合體分解調控、細胞周期，染色體組織及DNA修復相關。結合IPA分析，表明生物學過程的過度顯現與癌症、生殖系統、胃腸道和肝臟疾病還有和有機體損傷與異常有關。

接下來，研究人員通過從PhosphoSite-Plus database獲得的位點特異性激酶-底物關係注釋每個受調控的磷酸化位點的上游激酶，結果顯示在2327個受調控的磷酸化位點中只有119個蛋白上的152個位點在database中具有注釋信息。這一結果揭示了31個激酶包括Akt、CDK、EGFR、GSK、MAPK、RAF及Src等至少有一個或多個底物，表明Ctr調控大量激酶。

位點特異性激酶-底物關係注釋

通過使用STRING資料庫中的蛋白質-蛋白質相互作用信息進一步生成受Ctr調控的激酶與底物間的相互作用關係網路。該網路揭示了激酶和它們的底物之間複雜的蛋白質-蛋白質相互作用，涉及Ctr調控的不同宿主信號傳導途徑間的跨越。

受Ctr調控的激酶與底物間的相互作用關係網路分析

然而，大多數Ctr調控的磷酸化位點相關上游激酶是未知的，因此，研究人員利用GPS和motif-x生物信息學工具來進行分析。GPS軟體預測特定激酶或激酶家族使特定的磷酸化修飾位點發生磷酸化的可能性，motif-x軟體通過分析過表達的氨基酸序列模式生成潛在的激酶底物的基序。將這些激酶底物關係定位到人類激酶組樹上，發現在總細胞和核組分中調節細胞周期調控、MAPK信號傳導和剪接的CMGC激酶組佔比很高，如MAPK、CDK、GSK3、DYRK和HIPK，而核部分顯示CAMK、AGS和TKL激酶富集。

Ctr調控的磷酸化位點相關上游激酶預測分析

研究人員從磷酸化蛋白質組數據中發現了81個新的Ctr蛋白被磷酸化，其主要由內含物膜蛋白組成。為了推斷出起關鍵作用的宿主激酶，研究人員從HPRD資料庫中檢索到了激酶-底物關係，結果顯示Ctr蛋白受PKA、PKC、CK2、GSK3、GRK、CD5和ERK1/2等激酶調節。

預測參與調節所有磷酸化位點的宿主激酶

3. Ctr應答性轉錄組學和磷酸化修飾組學分析

總細胞中2倍以上差異蛋白的互作網路分析結果表明，由活化的包含有如ERF、YAP1和TNIP1等多種轉錄因子（TFs）的ERK1/2（MAPK1和MAPK3）調控的蛋白的主要功能模塊目前在功能上與Ctr感染無明顯相關性。為研究Ctr誘導的TFs磷酸化在病原體發育和宿主細胞生理上的影響，研究人員通過特異性磷酸化位點的免疫印跡實驗證實了其中3個TFs（ETS1、FRA1和ERF）在End1/E6E7細胞系和hCEcto細胞系中磷酸化修飾水平的差異表達。敲低ETS1和ERF會顯著降低Ctr的感染力，表明TFs在衣原體發育中的重要性。

為研究在Ctr感染中TFs在調控下游靶基因表達中所起的作用，研究者運用Ctr應答性轉錄組學和磷酸化修飾組學證明上皮間質轉移的特徵。結果顯示它們參與調控多種與炎症，血管生成，上皮細胞間充質轉化，腫瘤生長，細胞運動及侵襲相關的基因。與細胞運動（PLAU、PLAUR），侵襲性（SEMA7A）、炎症（IL8、TNF-α）、緊密連接（E-鈣黏蛋白）和基質金屬蛋白酶（MMP9）相關的基因在在急性和持續性感染的原發性人類外宮頸細胞中上調。

ctr調節基因的基因集富集分析

4. ERK調控Ctr應答FRA1、ETS1和ERF

在感染細胞中轉錄水平上調的EMT基因是否能夠誘導EMT表型？WB結果顯示持續性的Ctr感染會降低上皮標記物E-cadherin水平，而提升間充質標記物N-cadherin水平。通過Matrigel等實驗發現持續性Ctr感染會增加End1/E6E7和hCEcto細胞的侵襲性。

這些數據表明Ctr誘導的ERK信號通路對控制EMT的TFs的轉錄和轉錄後調控起重要作用。Ctr感染後，ERK介導的ERF的T526位點磷酸化會導致核輸出，降低抑制因子活性及促進侵襲。此外，依賴於ETS1的轉錄進程對Ctr誘導的EMT具有重要作用，Ctr調節ERK介導的TF調控從而誘導具有更高侵襲能力的EMT表型。

總結

本文通過磷酸化修飾組學和轉錄組學聯合分析，揭示了Ctr誘導的宿主細胞信號通路改變的複雜性及其對細胞功能的影響。研究結果全面的展示了宿主細胞總成分及核成分中Ctr應答性激酶網路，從結果中鑒定了受調控的ERK和MAPK的底物TFs的磷酸化水平，同時證明了ETS1和ERF在EMT表型形成中的作用。本研究結果揭示了更大範圍的Ctr調控的信號傳導，為Ctr致病過程以及其他人類生殖道感染提供新的見解。

病原菌和宿主之間的識別從本質上講是蛋白質之間的相互作用，基於生物質譜的蛋白質組技術，為精準醫學在蛋白質水平的生命過程和生命現象提供了強有力的武器，廣泛運用在感染性疾病的研究中。

參考文獻：

Zadora, P. K., et al. (2019). Integrated Phosphoproteome and Transcriptome Analysis Reveals Chlamydia-Induced Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Host Cells. Cell Reports.

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