體細胞克隆猴：開啟新葯研發「靈長類」時代

2019年1月24日，5隻生物鐘紊亂體細胞克隆猴登上中國綜合英文期刊《國家科學評論》封面。視覺中國

　　來源：科技日報

　　「開始做這個項目時，我的預期是2020年能做出來就很不錯了。」 中國科學院神經科學研究所（以下簡稱「中科院神經所」）所長蒲慕明告訴科技日報記者。

　　中科院神經所研究員孫強從蒲慕明那接到體細胞克隆猴任務時，給自己和團隊的時間是十年。事實上，他們僅用了五年就做出讓學術界矚目的成果。

　　2017年11月27日，世界上首隻體細胞克隆猴「中中」在中科院神經所、腦科學與智能技術卓越創新中心的非人靈長類研究平台誕生；同年12月5日，第二隻克隆猴「華華」誕生。這一成果標誌著中國率先開啟了以體細胞克隆猴作為實驗動物模型的新時代。

　　今年1月份，孫強團隊與同屬於中科院神經所的張洪鈞團隊合作，再獲佳績：在張洪鈞團隊利用CRISPR/Cas9技術成功構建世界首批核心節律基因BMAL1敲除獼猴模型的基礎上，孫強團隊通過一隻癥狀最明顯的公猴的體細胞克隆出五隻小猴。這項進展說明中國科學家已可以批量生產遺傳背景均一的疾病獼猴模型。

　　夢寐以求多年但無法達成的目標

　　遺傳背景單一的非人靈長類動物模型是科研人員夢寐以求多年但無法達成的目標。

　　「用小鼠做藥效檢測，可以剔除遺傳背景因素，更好地觀察藥效。」蒲慕明說。但是，由於小鼠的基因、代謝和腦組織結構和生理等方面與人類差別太大，部分藥物作用在人類和小鼠上的效果也差別巨大，相比之下，與人類基因更接近的靈長類動物顯然是更好的動物模型。

　　非人靈長類動物首選對象肯定是猴子。可是野生猴的遺傳背景各異、個體表徵差異難統一，每次科學實驗或藥物檢測的對照驗證，需要使用大量實驗猴，而且野生猴繁殖周期長、單胎數量少，驗證工作常常持續很多年，時間過於漫長。所以想將其作為動物模型，最大的難題就是如何獲得遺傳背景相同的猴子。

　　「小鼠繁殖很快，自然繁殖幾代後它們的遺傳背景就相同了。猴子繁殖一代就要五六年，所以唯一的辦法就是克隆。」蒲慕明說。

　　但克隆猴太難了。美國、中國、德國、日本、新加坡和韓國等世界科研機構都在攻關非人靈長類體細胞克隆，均未成功。此前，體細胞克隆猴最接近成功的一次是在2010年，美國俄勒岡靈長類研究中心在給代孕猴媽媽胚胎移植後的第81天發生流產。「只有獲得遺傳背景相同的克隆猴，才能最大程度發揮平台的作用，真正推進相關藥物的研發。美國科學家還差一半就成功了。我們也很有希望成功，但要做好剩下的一半。」蒲慕明說。

　　超高實驗技巧完成艱難的「另一半」

　　剩下的「另一半」卻遠比想像艱難許多。

　　孫強分析，在體細胞克隆猴技術具體操作上，主要有兩大難點。第一點，「拿掉細胞核的時候不能抽掉周圍太多營養物質，否則細胞就不發育了」。此外，移植到卵細胞中的，是成熟的、只表達某些特定基因的體細胞細胞核，研究人員需要想辦法讓它重新變成一個未分化的全能胚胎細胞。

　　孫強解釋道，由於猴子細胞不透明，在顯微鏡下看不到細胞核，需要通過偏振光才能把細胞核顯示出來。在孫強團隊的研究記錄視頻中，研究人員注視著顯微鏡，在一閃一閃的偏振光下，操縱10微米左右直徑的極細針頭在細胞里吸取、注射，並儘可能減小對細胞的損傷，其難度遠大於操縱繡花針。

　　除了去核要求速度快外，將體細胞核注入去核卵細胞同樣要求非常快，「我們的團隊成員可以做到15秒內實現體細胞注入操作，只有精湛的技術才可以保證對卵細胞損傷最小。」孫強說。

　　第二點，在核基因組啟動前，體細胞核要經歷一個回復到早期胚胎核狀態的過程，也就是重編程。只有將這個過程式控制制好，才能提高體細胞胚胎的發育率。在嘗試各種調控方法效果均不理想後，2014年，孫強團隊在一篇報道中看到一種新的酶處理方法，並最終用這一方法將囊胚率提升到45%，優質胚胎率升高到29%。最終，孫強團隊用127枚卵母細胞，做了109個重構胚胎，對21隻猴子受體進行移植，獲得6隻懷孕受體，最後只有兩隻在2017年順利出生。

　　「這個工作證實了獼猴可以用體細胞來克隆，並且，它可以成為有用的動物模型。」蒲慕明認為。

　　將構建足夠數量的疾病模型猴

　　短短一年後，中科院神經所科研團隊再次用體細胞克隆技術生成了5隻遺傳背景相同的模型猴——世界首批核心節律基因BMAL1敲除獼猴模型。記者在中科院神經所非人靈長類研究平台看到，一隻半歲多的猴子，躲在孵育箱角落裡。它就是神經所科研團隊創建的世界首例生物節律紊亂猴克隆後代之一。

　　生物節律的基礎研究與轉化干預目前亟須好的生物模型。2016年9月，張洪鈞團隊首次利用基因修飾方法，得到一批生物節律核心基因BMAL1缺失的獼猴。

　　然而，通過基因敲除方法獲得的第一代模型猴，容易產生嵌合體，這成了研究的最大阻礙。由於這一批猴的生物節律紊亂嚴重程度不一致，無法作為理想的動物模型。隨著「中中」「華華」的誕生，研究人員開始思考，能否利用克隆猴技術，構建出疾病模型猴？

　　孫強團隊馬不停蹄，在國際上首次獲得5隻遺傳背景一致的生物節律紊亂克隆猴。

　　「這個成果比首例體細胞克隆猴更進一步的地方在於，上次用的是流產胚胎的體細胞，這次用的是活猴的體細胞來克隆的，可以在兩代猴之間進行比對。」蒲慕明說，更重要的是，此次克隆的是一種有疾病表型的猴，這首次證實通過體細胞核移植技術可以克隆成年基因修飾猴，進一步表明克隆猴作為疾病模型的有效性。

　　「這些腦疾病模型克隆猴，未來將有助於解析腦重大疾病的致病機理、確立預警和早期診斷指標、進行干預和治療等。建立基於疾病模型猴的非人靈長類平台，將成為中國腦計劃的一大亮點。」蒲慕明表示。

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