兩點一線 探尋細胞生命的「年輕因子」

在對生命本源的幻想中，人們總是前往隱秘之處尋找「不老泉」，而事實上，生命不老的秘密或許在它最小的單位中——

3月26日，我國科學家首次鑒定出使衰老間充質幹細胞重獲活力的「年輕因子」——多梳蛋白4（CBX4），並對其功能進行了驗證，相關研究成果發佈於《細胞報道》上。

幾天後的4月1日，《公共科學圖書館·生物學》發表了同一科學家團隊的另一個全新發現，首次在人間充質幹細胞中確立了「年輕通路」——YAP-FOXD1，並證明該通路的激活可減輕細胞衰老及骨關節炎。

如果說前者是科學家團隊在幹細胞中發現了「不老泉眼」，那麼後者的研究則是「兩點一線」地確定了細胞生命的「青春之河」。

「該研究揭示了YAP-FOXD1通路在人幹細胞去衰老及骨關節炎基因治療中的作用與分子機制。」論文通訊作者之一、中國科學院生物物理研究所研究員劉光慧介紹，研究由中科院生物物理所劉光慧研究組同北京大學湯富酬研究組、中科院動物所曲靜研究組合作完成，研究團隊歷經五年的努力從縱橫交織的細胞基因調控網路中，證明了YAP-FOXD1通路的存在，並通過細胞和動物水平的實驗證明了它的功能。

為癌基因「正名」 YAP蛋白充當「年輕因子」

YAP-FOXD1通路中最先撞入科學家視野的是YAP蛋白。網上搜索YAP蛋白的「簡歷」，可以發現，與它關係最密切的是一條被業內稱為「河馬通路」的Hippo信號通路。

「河馬通路」的上游一旦接收到抑制生長的信號，經過一系列激酶磷酸化反應後，最終以磷酸化的形式作用於下游效應因子YAP蛋白，決定YAP蛋白的磷酸化與否。

如果不被磷酸化，沒有磷酸化基團「尾巴」的拖累，YAP便能夠輕易進入細胞核，進入基因調控的大本營。這時YAP扮演的是「傳令官」，它在大本營里的出現引來基因的活躍，它會選擇與自己的靶基因結合，「傳令下去」，催促靶基因表達出相應的RNA和蛋白質，從而影響細胞的生命活動。

「我們首先找到了YAP，它是一個功能明確的轉錄輔助激活因子。」劉光慧說，在細胞核里YAP可以和它的轉錄因子「夥伴」TEAD結合，共同激活下游靶基因的轉錄。

YAP如果帶上了磷酸化基團的「尾巴」，就會被阻滯留在細胞質中，YAP無法到細胞核中「傳令」，下游基因的轉錄表達受到抑制，細胞增殖也會受到抑制。

有報道指出，如果YAP進行頻繁「傳令」、不受節制，將會讓細胞無限制增殖，進而可能引發腫瘤，因此被認為是一種「癌基因」。

YAP的特性給了研究團隊兩個任務：一是從功能上證明，它的存在與否是否與細胞的「年輕態」相關；二是它如何把「命令」傳遞下去進而調控功能基因的功能呢？它的「接令員」是誰，之前有沒有被其他科學家找到呢？

為回答第一個問題，團隊從正反兩個角度進行驗證。「我們通過CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術，發現了一系列可以延緩人類間充質幹細胞衰老的蛋白。這些蛋白敲除後細胞會出現加速衰老的表型。」論文第一作者、中國科學院生物物理研究所博士生付麗娜說，基因敲除的工作開始於人胚胎幹細胞，通過導入3種不同質粒，研究團隊讓人幹細胞基因組中負責編碼YAP蛋白的那段基因發生缺失。

「敲除的基因組DNA大概是幾千個鹼基，雖然敲除幾個鹼基也可能使得YAP因子失去功能，但是很可能導致新的異常蛋白的產生，從而引入無法排除的因素。」付麗娜說。團隊必須確保YAP基因的完全沉默。為此，他們對CRISPR/Cas9基因編輯技術進行了改良，使其能夠對巨大的YAP基因位點進行較大片段的刪除。

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，團隊獲得了YAP特異性敲除的人胚胎幹細胞，通過定向分化技術，將人胚胎幹細胞定向誘導分化為間充質幹細胞。「YAP缺失的人間充質幹細胞表現出嚴重的加速衰老表型。」劉光慧說，YAP在維持人成體幹細胞年輕態中發揮著關鍵作用，雖然YAP在某些腫瘤細胞中被證明具有「癌基因」的功能，但在人間充質細胞中卻扮演著「年輕因子」的角色。

全新的「兩點一線」 找到YAP蛋白「鐵杆夥伴」和「接令員」

YAP通過與轉錄因子TEAD的相互作用來啟動下游基因的轉錄，也就是說TEAD和YAP是「鐵杆夥伴」。此前研究發現，YAP和TEAD通過YAP的N末端和TEAD的C末端間相互作用形成蛋白複合物，該蛋白複合物在YAP介導的細胞增殖中發揮著關鍵性的作用。

團隊的第二個任務是尋找YAP的「接令員」。「我們假設YAP的某個或某些靶基因介導了人間充質幹細胞年輕態的調節。」劉光慧說，「通過系列實驗，我們發現YAP可以轉錄激活FOXD1，這是一個新型的YAP靶基因，之前從未被報道過。」

叉頭框（FOX）蛋白家族包含50多個轉錄因子，在胚胎髮育、細胞周期調控、糖類和脂類代謝、衰老調節等多種生物學過程中發揮作用。FOXD1是其中一個轉錄因子。付麗娜解釋，之前有報道指出FOXD1能調節器官發育，並具有促進細胞增殖和細胞重編程的活性。

「我們首先對YAP敲除的人間充質幹細胞進行了RNA測序，進一步結合轉錄因子結合元件的預測，我們推斷FOXD1可能是YAP的一個新型靶基因。」付麗娜說，隨後，為了驗證推斷，團隊利用染色質免疫沉澱（ChIP）方法「釣」出能夠特異性地結合FOXD1啟動子DNA的蛋白（即YAP），最終證明是FOXD1從YAP處接過「命令」，開啟調節細胞「年輕化」的分子程序。

「YAP是上游，FOXD1是下游。它們是一對命運共同體。」劉光慧解釋，隨著細胞衰老，YAP和FOXD1的表達都發生了一致性下調。

或助力基因治療 未來可有效干預衰老相關疾病

從幹細胞出發，發現機制機理，再回到細胞、生命體驗證，「青春之河」的發現必須在生物體中證明自己的「魔力」。

「我們在三種細胞衰老模型中證明了YAP-FOXD1通路的去衰老作用，YAP或FOXD1的過表達能使衰老的人間充質幹細胞重新獲得增殖能力。」付麗娜說。另一方面，細胞實驗的結果提示了過表達YAP或FOXD1可能使衰老的動物間充質組織（如關節）變得更加年輕。

團隊接下來在動物身上實施了基因治療。「我們在小鼠體內證明了YAP或FOXD1蛋白的過表達作為骨關節炎基因治療方案的可行性和有效性。」劉光慧說，團隊以慢病毒載體為基因導入媒介，將編碼YAP或FOXD1蛋白的慢病毒注射到患有骨關節炎的小鼠的關節腔內。數周的YAP或FOXD1基因治療均可顯著降低關節軟骨中衰老細胞的比例，有效抑制關節軟骨退化及關節腔炎症，從多個方面改善骨關節炎的病理表型。

骨關節炎是典型的與細胞衰老關係密切的人類疾病。這些研究結果均證明，通過基因導入幹細胞「年輕因子」，有望在未來治療以骨關節炎為代表的衰老相關疾病。找對「不老泉眼」或者「青春之河」，將為基因治療提供明確的標靶，最終對衰老相關疾病的干預提供有效的解決方案，並進行臨床應用。

（來源：科技日報）

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