WT1 基因與惡性腫瘤靶向免疫治療

【摘要】WT1（Wilm"s tumor gene）基因在白血病及各種實體腫瘤包括肺癌和乳腺癌中高表達，且在這些惡性腫瘤中起癌基因作用，提示了WT1 蛋白可以作為一個新的超表達的腫瘤抗原。WT1 九聚肽體外樹突狀細胞誘導細胞毒性T 淋巴細胞（CTL）產生WT1肽特異性CTL，這種CTL可以殺傷內源性表達WT1的白血病和實體瘤細胞。I 期臨床試驗結果提供了WT1肽可能作為免疫製劑而用於臨床的依據。

【關鍵詞】基因；腎母細胞瘤；白血病；免疫療法

白血病患者行異基因骨髓移植（all0-BMT）後的移植物抗白血病（graft-versus-leukemia,GVL）效應為腫瘤免疫效應提供了令人信服的依據，證明了免疫治療腫瘤的合理性。尋找廣泛表達的腫瘤抗原作為HLA-1 類抗原限制的細胞毒T淋巴細胞（CTLs）的作用靶點，對發展T細胞介導的腫瘤免疫治療顯得尤為重要。近年來，隨著抗原提呈細胞（APC）和效應細胞相互作用的分子機制和生物信息學的研究進展，研究人員鑒定了許多可能用於免疫治療的候選抗原。研究發現WT1基因參與人類的造血調控，在多種白血病及實體瘤中WT1基因異常高表達。本研究就WT1基因的結構功能特點及其在惡性腫瘤靶向免疫治療中的作用作綜述。

1、WT1 的結構和功能

WT1（Wilm"s tumor gene）基因定位於11p13，是最早發現與Wilm"s腫瘤發生、發展有關的基因[1]，全長約50kb，有10個外顯子，轉錄產物長約3kb，編碼一個相對分子質量約（52~54）X10^3的，具有激活和抑制雙重功能的轉錄調控蛋白。該蛋白由兩個功能結構域組成：C端有Cys2-His2的鋅指結構，為序列特異性的DNA結合區；N端富含谷氨酸及脯氨酸，為轉錄調控區域。WT1蛋白能與許多生長調控因子基因及其其受體結合 [ 如胰島素樣生長因子2（IGF-2)、胰島素樣生長因子1 受體（IGF-1受體）、血小板衍生生長因子A（PDGF-A）、表皮生長因子 （EGF）、轉化生長因子β（TGF-β）、維生素D受體、bcl-2和c-myc基因等，以及WT1自身富含「GC」的DNA同源序列（5GCGGGGGCG-3）]，從而影響這些靶基因的啟動子活性，調節這些細胞生長因子 的轉錄。WT1對轉錄起激活還是抑制作用，取決於細胞組織類型、WT1異構體的不同及與其他基因的相互作用。野生型WT1基因通過不同的RNA選擇性剪切形式，共可編碼出至少24種不同的拼接異構體，這些蛋白同工異構體各具不同的生物學功能[2]，其中主要兩種選擇性剪接，編碼4種異構體。第一種剪接位於外顯子5，編碼17個氨基酸插入鋅指結-構和調控區，稱為WT1 17AA/—17AA；第二種剪接編碼3個氨基酸[賴氨酸-蘇氨酸-絲氨酸（KTS）]插入外顯子9和10，即第3和第4鋅指區之間，稱為WT1 KTS/-KTS。兩種剪接形式使用WT1在連接DNA的特性方面及調控基因轉錄方面的作用不同。

2、WT1基因在白血病中的表達特點

WT1主要在胚胎髮生過程中表達，對泌尿生殖系統的發育起重要作用。在成人，WT1僅在腎小球足細胞層、卵巢的顆粒細胞、子宮內膜、睾丸Sertoli細胞、間皮細胞、乳腺導管和小葉、脾臟及骨髓的早期未成熟的造血細胞中微量表達，因些WT1基因表達具有嚴格的組織特異性。1992年Miwa等[3]首先報道了用Northern blot方法證實在44%急性淋巴細胞白血病（ALL）和68%急性髓細胞白血病（ALL）患者中有WT1超表達。隨後許多研究發現幾乎所有的白血病原始細胞（無論系別）中短暫表達形成鮮明對比，且在大多數這類原始細胞中，WT1核蛋白可被撿出。AML各亞型中，M0-3高表達，M4尤其M5低表達，流式細胞儀篩選的CD34-CD33 細胞高表達WT1。

在ALL中，CD19 CD20-前B細胞急淋WT1的表達是CD19 CD20-前B中間型急淋的20倍； FAB分型中L2型WT1表達高於L1型，T-ALL表達高於B-ALL。慢性粒細胞白血病患者隨著病情從慢性期進展到急性期，WT1表達水平逐漸增高，與病情進展相平行。骨髓增選異常綜合征（meyelodysplastic syndrome,MDS）隨著從難治性貧血（RA）經難治性貧血伴原始細胞過多（RAEB）和難治型貧血伴原始細胞過多轉變型（RAEB-T）到完全轉化成急性白血病（AL），WT1基因表達水平顯著上升，與病情進展相平行。慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病、漿細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤中WT1不表達，提示了WT1表達僅限於不成熟的白血病細胞。ALL患者WT1超表達，其表達水平與性別、年齡、FAB分型、乳酸脫氫酶水平、染色體核型及前期MDS等無關，故其可成為一種「泛白血病」標誌[4]。

關於WT1表達與白血病預後的關係，實時定量-PCR結果提示，在正常者及純化CD34 細胞僅表達極微量WT1轉錄本，甚至在正常外周血（peripheeral blood,PB）檢測不到；相反，在所有的急性白血病初診時，其骨髓（bone marrow,BM）和PB中WT1表達很高。隨訪WT1表達與其他用來監測微小殘留病灶（minimal residual disase,MRD）分子標誌（融合基因產物、流式細胞儀檢測）的意義相同。且在AL隨訪中，WT1再次增高往往預示著複發；精確定量外周血幹細胞（PBSCs）中WT1表達水平，可以評估AML患者自體造血幹細胞移植（APBSCT）後的複發[5-7]。因此認為WT1可作為泛白血病標誌基因來監測MRD，提示WT1可作為白血病治療的靶點[8]。

3、WT1基因在實體瘤中的表達特點

研究發現WT1基因在多種實體瘤包括乳腺癌、結腸癌及肺癌組織中均超表達，WT1蛋白可以作為惡性腫瘤抗原。Oji等[9]採用RT-PCR檢測了34株實體瘤細胞系中WT1的表達水平，結果發現胃癌（3/4）、結腸癌（5/5）、肺癌（12/15）、乳腺癌（2/4）及卵巢癌（2/2）、胚胎細胞腫瘤（1/1）、子宮癌（1/1）、甲狀腺癌（1/1）和肝癌細胞（1/1）系均表達WT1，也即82%（28/34）實體瘤細胞系表達WT1。採用PCR-SSCP法進一步對其中3株表達WT1的細胞系（胃癌AZ-521、肺癌OS3及卵巢癌TYK-nu）分析WT1基因突變與後缺失情況，結果未發現任何突變，而且該3株細胞系經WT1反義寡核苷酸技術處理後，WT1蛋白表達水平均下降，細胞生長受抑制；進一步將WT1基因持續強行表達於上述癌細胞中，能夠抑制反義寡核苷酸對癌細胞生長的抑制效應。這些結果提示了WT1基因在實體瘤生長過程中起重要作用，而且是起了癌基因作用而不是抑癌基因作用。

Menssen等[10]用RT-PCR法檢測，結果發現膠質母細胞瘤（5/8）、肺癌（5/11）、結腸癌（5/15）細胞株中存在WT1表達，而HT29結腸癌細胞株在誘導分化後WT1表達缺失。

Loeb等[11]研究發現WT1蛋白在原發性乳腺癌中高表達，而在正常乳腺上皮組織中表達不高，而且原發性乳腺癌（6/19）組織中WT1啟動子甲基化，正常乳腺上皮組織中不存在WT1啟動子甲基化。

Miyoshi等[12]採用實時定量PCR技術檢測了99例乳腺癌組織中WT1 mRNA表達水平，結果發現WT1 mRNA表達水平與臨床病理參數（如：絕經狀態、腫瘤大小、淋巴結狀態、組織學分類及雌激素受體狀態）無關，WT1 mRNA高表達者5年無病生存率為62.5%，明顯低於WT1低表達者（77.2%）；多變數分析顯示WT1為獨立於其他傳統因素的重要的乳腺癌預後因素，因而認為檢測腫瘤組織中WT1表達水平為乳腺癌患者的極用價值的預後因素。

Zapata-Benavides等[13]研究發現WT1高表達與乳腺癌患者預後差相關，WT1表達水平與乳腺癌細胞增殖成正相關。採用脂質體包裹WT1反義脫氧寡核苷酸技術下調WT1表達能抑制乳腺癌細胞生長，降低細胞周期蛋白D1的水平，這些結果提示WT1蛋白通過促進乳腺癌細胞增殖導致乳腺癌進展。

Oji等[14]採用實時定量-PCR技術及免疫組化技術檢測發現，所有食管鱗狀細胞癌患者組織中均超表達WT1；並且在20例食管鱗狀細胞典型增生組織中可以檢測到WT1蛋白；RT-PCR結果顯示83%（10/12）腸癌細胞系中高度表達WT1 mRNA，而採用實時定量-PCR檢測結果提示87%（13/15）原髮結腸腫瘤中WT1 mRNA超表達，僅 2 例原發腫瘤低表達WT1 mRNA，而所有樣本的正常結腸黏膜組織中均檢測到WT1 mRNA低表達。對PCR產物進行測序分析顯示， KTS和-KTS兩種異構體均可被檢測出，但未發現鋅指結構突變，提示為野生型WT1表達[15]。

4、WT1基因靶向免疫治療惡性腫瘤的實驗研究

由於WT1基因在白血病及各種實體瘤包括肺癌和乳腺癌中高表達，且在這些惡性腫瘤中起癌基因作用，提示了WT1蛋白可以作為一個新的超表達的腫瘤抗原。許多學者從事靶向WT1免疫治療白血病和實體瘤在體內及體外的實驗研究。理論上，多種肽疫苗（野生型WT1蛋白序列）、肽鏈負載樹突狀細胞（DC）、輸注WT1特異性CTL和WT1 DNA疫苗均能用於產生細胞介導的針對WT1的特異免疫，WT1基因可作為CTL介導的白血病細胞體外純化的理想靶點和白血病及其他表達WT1的惡性腫瘤體內抗原的特異性治療靶點。

4.1 WT1肽特異性細胞毒T淋巴細胞清除腫瘤細胞

Oka等[16]第一次將超表達的腫瘤抗原WT1作為MHC I類抗原限制性CTLs作用的靶分子，用於T細胞介導的白血病免疫治療。他們選擇併合成了4種源於WT1蛋白並含有HLA-A2.1分子結合錨位的九聚肽鏈，Db126肽段（RM-FPNAPYL residues 126-134）、WH187肽段（SLGEQQYSV residues 187-195）、Db235肽段(CMTWNQMNL residues 235-243）和WH242肽段（NLGATLKGV residues 242-250），其中兩種肽段Db126和WH187被證實在體外能與HLA-A2.1分子結合，誘導產生WT1肽特異性CTLs。這兩種肽刺激的T2細胞在體外反覆致敏健康HLA-A2.1 供者外周血單個核細胞，產生的CD8 細胞毒T淋巴細胞能特異性地以HLA-A2.1限制方式溶解WT1肽刺激的T2細胞。該CTLs同時能特異地溶解WT1 /HLA-A2.1 白血病細胞，但不能溶解WT1 /HLA-A2.1-白血病細胞及WT1 /HLA-A2.1 B淋巴樣細胞。

Gao等[17]也證實兩種針對WT1肽段的CTL細胞株均能以HLA-A2.1限制性的方式選擇性殺傷表達WT1的白血病細胞，並抑制HLA-A2.1 白血病轉化的CD34 祖細胞的克隆形成，但正常CD34 干祖細胞的功能不受影響。

2000年Ohminami等[18]用WT1來源的肽段負載樹突狀細胞，再反覆致敏CD8 T細胞，建立了一個HLA-A24限制性特異針對WT1來源多肽（CMTWNQMNL residues 235-243）的抗白血病CTL細胞株TAK-1。

2002年Azuma等[19]又建立了WT1來源多肽（RQPSCQKKF residues 417-425）特異性的CD8 CTL細胞株NIM-1。它們均能溶解HLA-A24 並表達WT1的白血病細胞，但不能溶解HLA-A24-白血病細胞或正常細胞。以上結果提示WT1肽鏈特異性CTL忽略了表達生理水平WT1的正常細胞。同時TAK-1及NIM-1對白血病細胞的細胞毒性不協同，提示通過CTLs識別單一的腫瘤特異性抗原決定簇，就足以對腫瘤細胞發揮最大的細胞毒作用。由此，說明WT1是CTL介導的體外白血病祖細胞清除和表達WT1白血病的抗原特異性治療的理想靶位，從而為發展以WT1為靶分子的選擇性T細胞治療和針對白血病和實體瘤的WT1疫苗奠定了基礎。

Tsuboi等[20]將天然WT1v9肽段CMTQNQMNL第2位的M用Y替換，這種修改過的肽段與HLA-A*2402的親和力更強，免疫性更高，能更有效地誘導出WT1特異性的CTL，後者識別並殺傷天然WT1肽段衝擊致敏的CIR-A*2402細胞及內源性表達WT1的原代白血病細胞。TAK-1能夠抑制HLA-A24 肺癌細胞株，而對HLA-A24-無細胞毒作用；向移植HLA-A24 肺癌細胞株的裸鼠輸注TAK-1細胞，可抑制癌細胞生長並延長生存期[21]。這一研究結果證實了WT1基因可以作為泛腫瘤相關抗原，且WT1靶向免疫治療為白血病和肺癌患者提供了一種治療選擇。

4.2 WT1疫苗治療惡性腫瘤

免疫接種的根本目的是增加直接針對疫苗中抗原的抗原特異性T細胞和B細胞的數目。每一次免疫接種使抗原特異性T細胞數量增加，然而，最終抗原特異性T細胞數目將到達平台期；體內T細胞和B細胞的免疫記憶可因核苷酸疫苗編碼蛋白的持續表達而不斷增強，從而實際長久免疫。因此抗原特異性疫苗具有一定局限性。而治療性WT1疫苗應用於微小殘留白血病患者可以產生足夠數目的免疫T細胞，阻止疾病複發和進展，未盡需要體外T細胞擴增和輸注。

Tsuboi等[22]將能編碼全長WT1蛋白的質粒DNA行肌肉注射入C57BL/6G小鼠，被接種的小鼠能產生針對於WT1蛋白的CTLs，後者能以MHC-I限制性的方式殺傷表達WT1的白血病細胞，而且這種接種過的WT1疫苗的小鼠能排斥皮下接種表達WT1抗原的腫瘤細胞，表明用WT1質粒DNA預防接種能誘導出WT1抗原特異性的CTLs，並使接種小鼠獲得對WT1抗原表達的腫瘤細胞的排斥活性。

Gaiger等[23]分析了63例AML和81例CML患者血清中全長蛋白或剪接的WT1抗體，結果25%AML和19%CML患者血清中可檢測到對WT1蛋白的N端反應。

Wu等[24]研究發現白血病和MDS患者中針對WT1蛋白的IgM和IgG抗體檢出率及滴度均高於健康對照志願者。進一步研究IgG介導對WT1的體液免疫反應，結果發現白血病和MDS患者中Th1型WT1抗體如IgG1、IgG2和IgG3檢出率及抗體滴度明顯高於健康志願者，而Th2型WT1抗體如IgG4無明顯增加，提示了白血病和MDS患者體內產生針對WT1蛋白的是Th1型體液免疫反應。這一結果提示針對WT1蛋白的Th1型細胞免疫反應是WT1靶向免疫治療腫瘤的重要方式。

Nakajima等[25]首次採用WT1多肽聯合牛分枝桿菌卡介功細胞壁骨架（BCG-CWS）接種能更有效清除WT1表達的腫瘤細胞，提示BCG-CWS具有增強天然免疫能力，聯合WT1肽接種能夠增強WT1特異性免疫反應（獲得性免疫）。

4.3 WT1肽特異性CTL免疫治療腫瘤的I期臨床試驗結果

Oka等[26-27]首先進行了以WT1肽為基礎的腫瘤免疫治療臨床試驗。在I期臨床試驗中將MDS或MDS伴骨髓纖維化轉化的患者確定為白血病患者，皮內注射HLA-A*2402限制的WT1九聚肽（Montanide ISA51輔劑乳化）；單劑量WT1接種後即能增加WT1特異性CTLs，並使白血病原始細胞快速下降。隨後該研究小組又詳細報道了WT1肽為基礎的免疫治療乳腺癌、肺癌、MDS、急性白血病 I 期臨床試驗結果。總共有26例患者接受了WT1肽注射（至少1次以上），其中18例患者注射WT1肽≥3次。毒性反應主要是注射部位出現局部紅腫；乳腺癌、肺癌或AL造血正常，而MDS患者由於表達WT1基因的轉化型造血幹細胞產生異常造血導致白血病細胞下降、腫瘤縮小或腫瘤標誌物減少；注射WT1疫苗後WT1特異性CTLs增產率與臨床反應呈正相關。因此WT1疫苗能產生WT1特異性CTLs，使腫瘤緩解，而對正常組織無影響，為以WT1肽為基礎的免疫治療成為白血病或MDS患者的治療方法提供一線臨床資料。

Mailander等[28]報道了1例複發白血病患者採用WT1肽免疫接種治療後獲再次完全緩解，且體內實驗研究未發現腎毒性及明顯的血液學副反應。Tsuboi等[29]對2例進展期肺癌患者行皮內注射0.3mg HLA-A*2402限制的WT1九聚肽，每2周接種1次WT1疫苗可使腫瘤標誌物如CEA和Sialy Lweisj（x）（SLX）下降，同時產生一過性腫瘤組織縮小，除了注射部位局部紅斑並無其他副反應出現。

5、結束語與展望

WT1基因在白血病和多種實體瘤（包括肺癌和乳腺癌）中表達，且在這些惡性腫瘤中起癌基因作用，提示了WT1蛋白可以作為一個新的超表達的腫瘤抗原。HLA-A*2402（或HLA-A0201）限制的WT1 9聚肽體外刺激外周血單個核細胞可以產生WT1肽特異性CTL，這種CTL可以殺傷內源性表達WT1的白血病和實體瘤細胞。造血系統疾病如AML、CML和MDS患者體內可以檢測出抗WT1的IgM和IgG抗體，提示了WT1蛋白在白血病中超表達具有真正的免疫原性。I 期臨床試驗結果提示了以WT1肽作為基礎的免疫治療用於白血病及實體瘤患者具有較好的臨床作用。然而，目前以WT1肽介導的腫瘤免疫治療其局限是只能用於具備特定HLA-A表型的白血病患者。由於WT1在正常CD34 造血幹細胞及其他組織幹細胞中低表達，抗原在正常組織中表達有可能刺激免疫耐受而鈍化T細胞反應，克服WT1免疫耐受的許多研究正在進行中。

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