Science：新方法「劍指」CRISPR脫靶效應，努力攻克臨床應用「絆腳石」

共同作者Stacia Wyman (左) and Beeke Wienert (右) ，通訊作者Jacob Corn (中)

「魔剪」技術CRISPR自2012年問世以來，在治療多種難治性疾病方面顯示出巨大的潛力。CRISPR是通過在特定位點切割DNA來編輯基因組，但有時該工具也會「出錯」，比如說在DNA的其他地方進行切割，即所謂的脫靶效應。科學家們一直在努力攻克這個將CRISPR技術應用於臨床的「絆腳石」。

DOI: 10.1126/science.aav9023

現在，Gladstone研究所和創新基因組學研究所（IGI）的科學家與阿斯利康合作開發出一種識別這些不必要切割的新方法。相關結果於4月19日發表在《Science》雜誌上。Beeke Wienert博士與Stacia Wyman同為該篇研究論文的第一作者，Jacob Corn為通訊作者。

Beeke Wienert博士說道，「當CRISPR切割時，DNA被破壞，為了生存，細胞將許多不同的DNA修復因子聚集到基因組中的特定位點以修復斷裂並將切割末端連接在一起。如果我們能夠找到這些DNA修復因子的位置，就可以確定CRISPR的切割位點。「

MRE11標誌著Cas9 DNA斷裂點

為了驗證這一想法，他們研究了一組不同的DNA修復因子。結果發現， MRE11是最先到達DNA切割位點的蛋白質之一。MRE11就像寶藏地圖上的指引點，告訴研究人員蛋白質的去處。研究人員利用MRE11開發了一名為DISCOVER-Seq的新技術，該技術可以識別出CRISPR切割基因組的確切位點。

人類基因組非常龐大，如果完整地列印出所有DNA序列，可能是一本高達16層樓的書籍。而利用CRISPR對DNA進行切割時，就像試圖從書中刪除特定頁面上的一個特定單詞一樣，有點像大海撈針。然而，令人驚喜的是，MRE11竟然可以精確刪除特定單詞的所有字母。

與之前僅限於在實驗室中通過細胞培養的檢測脫靶效應不同，新的DISCOVER-Seq方法依賴於細胞的自然修復過程來識別切口，所以它侵入性更小且更可靠。「在誘導多能幹細胞、患者細胞和小鼠中，我們測試了新的DISCOVER-Seq方法。結果表明，新方法可以用於任何系統，不僅僅限於實驗室。」 通訊作者、蘇黎世聯邦理工學院開設實驗室的Jacob Corn博士說道。

值得關注的是，DISCOVER-seq是第一種可以在任何活體組織中直接從CRISPR編輯工具中找到切割位點的方法。MRE11蛋白是關鍵DNA修復途徑中最早的參與者之一，存在於哺乳動物細胞系（小鼠和人類）。這意味著它可以應用於任意查找切割位置，並且可以輕鬆應用於以前難以使用的不同系統。「目前已經有一些非常好的脫靶方法，但它們在高度控制的系統中效果最好，如實驗室培養的細胞。」Corn說，「DISCOVER-Seq的一個優點是，它可以在任何基因組編輯工作的系統中找到脫靶。「

因為MRE11允許研究人員在切割後立即放大切割位點，研究人員也發現DNA修復工作的新方法，他們最終可能會利用這些知識來改進CRISPR-Cas9基因組編輯。

加州大學舊金山分校（UCSF）的醫學遺傳學和分子藥理學教授Conklin對DISCOVER-Seq新方法的發現十分興奮。他說，「DISCOVER-Seq大大簡化了識別脫靶效應的過程，同時也提高了結果的準確性，讓我們可以更好地預測基因組編輯如何在臨床環境中發揮作用。」

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參考資料：

[1]New method to detect off-target effects of CRISPR

[2]Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq

[3]DISCOVERing Off-Target Effects for Safer Genome Editing

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