解析CRISPR高效適應機製取得新進展

CRISPRs（全稱clustered regularly interspaced short palindromic repeats，即「成簇的規律性間隔的短迴文重複序列」）與Cas蛋白（CRISPR-associated proteins）共同構築了原核生物界的一道適應性免疫防線。當病毒等外源DNA入侵細菌或古菌時，Cas蛋白可獲取入侵病毒特定DNA序列整合至CRISPR結構中，從而對該病毒產生永久性「記憶」，這些記憶性序列稱為spacer。這些序列的轉錄本經加工後產生成熟的crRNA，後者指導Cas蛋白特異地識別和切割再次入侵的病毒DNA。該系統豐富多樣的功能組分和核酸靶向機制，為人類提供了迄今最高效的基因組編輯技術（如CRISPR-Cas9系統）和基因檢測技術（如CRISPR-C2c2/Cas13a系統），同時為人們理解生命的進化與適應機制提供了重要素材。

中國科學院微生物研究所微生物資源前期開發國家重點實驗室向華研究組是我國較早從事CRISPR-Cas系統基礎研究的團隊，面對國際上很長一段時間內缺乏CRISPR從純病毒高效獲取spacer的適應系統的困境，他們於2014年從遼寧廢棄的海水曬鹽場分離到一株嗜鹽古菌病毒，在古菌中建立了首例（所有系統中第二例）CRISPR-Cas對純病毒的高效適應體系，揭示了該過程的「引發」本質，並首次提出引發適應可能是CRISPR在自然界中對病毒發生高效適應的主要模式（Nucleic Acids Res., 2014，42：2483–2492），這一論斷現已得到國際同行的廣泛認同，並推動了高效適應實驗模型的廣泛建立和研究。近年來，他們利用這一高效適應模型，進一步揭示了引發過程中嚴謹的異己區分機制——基於引發位點的PAM識別（Nucleic Acids Res., 2014，42：7226–7235）；spacer獲取複合物對整合位點的精確識別原理——基於repeat兩個內部元件的識別和「雙分子尺」機制（Nucleic Acids Res., 2016，44：4266–4277）；spacer底物切取過程中尺寸多態性原理——基於末端鹼基的識別偏好性（Nucleic Acids Res., 2017，45 : 4642-4654）。上述原創性發現系統揭示了CRISPR引發適應過程的核心功能和機制，已被Nature，Cell，Science，PNAS等引用150餘次。最近該研究組進一步揭示「引發」機制賦予了CRISPR極強的病毒適應能力，為理解I型CRISPR系統的工作機制提供了更深入的素材和視角，相關論文發表在最新一期的《核酸研究》（Nucleic Acids Res）上。

雖然「引發」機制對於CRISPR免疫的重要性已成為科學家們的普遍共識，但這一認識僅限於逃逸病毒的再次入侵，或近緣病毒（與spacer來源病毒具有相似的序列）的入侵等生理場景。向華課題組近期通過對引發crRNA分子進行大量改造，發現當改變該分子的一些保守特徵時（如3′端保守handle序列缺失、5′末端的羥基基團替換成三磷酸基團等），crRNA的胞內穩定性和濃度大大降低，同時該分子介導的病毒干擾過程幾近被阻斷；但值得注意的是，引發適應過程幾乎不受影響，甚至會有所增強（如圖）。更令人吃驚的是，該RNA分子最少僅需要5′端的6個保守鹼基（當然還有spacer序列）就可以引發適應過程。另外，引發過程比干擾過程還能耐受更大範圍的spacer長度變化。這些數據表明，引發過程中crRNA分子的可塑性極強，且極低的胞內濃度即可引發高效的適應過程，凸顯了引發機制超凡的高效性和魯棒性，與早前發現的引發適應嚴格異己區分機制相得益彰；而相比之下，干擾過程耐受性較差，需要較高的crRNA胞內濃度。這暗示在病毒侵染初期，引發適應可通過從病毒快速獲取新spacer提高有效crRNA分子的濃度，強化干擾效果，這對清除快速複製增殖的病毒分子非常重要。因此，他們認為「引發」機制對CRISPR免疫的重要性體現在多個層面，在病毒侵染初期（強化對病毒干擾效果，保障對快速複製的病毒分子的徹底清除）和病毒侵染後期（應對病毒逃逸突變，保障對不斷進化的病毒分子的快速適應）均發揮重要作用，這也可能解釋了具備該機制的I類CRISPR系統在自然界中的更高普遍性。

該研究成果發表在國際學術期刊Nucleic Acids Research上，龔路遙是該論文（Nucleic Acids Res., doi: 10.1093/nar/gkz244）的第一作者，向華和李明為該論文通訊作者。該研究得到國家自然科學基金委、國家轉基因科技專項和中國科協青年人才托舉工程的資助。

圖：crRNA分子保守結構的改變顯著降低其穩定性和干擾能力，而引發適應仍可高效發生（Nucleic Acids Res., 2019, doi: 10.1093/nar/gkz244）

來源：中國科學院微生物研究所

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