中國學者首次對賀建奎事件發表正式學術評論：存在嚴重科學問題，感到極其憤怒
今日凌晨，兩位中國學者在PLOS Biology發表觀點文章，對賀建奎基因編輯嬰兒事件進行學術性評論。這是 2018 年 11 月底賀建奎公布基因編輯嬰兒誕生後，中國學者首次從科學原理、實驗設計和數據的角度，在學術期刊上發表正式同行評議文章，針對這一震驚全球的科學事件發聲和表態。
文章的兩位作者均為活躍在基因編輯領域的學者：中科院動物研究所研究員王皓毅和中科院神經科學研究所研究員楊輝。兩人都是胚胎基因編輯方面的專家，多次在Cell、Nature Biotechnology、Cell Research等重要期刊發表論文。
王皓毅對「科研圈」表示：「去年這件事情發生之後，我們基因編輯領域的同行都非常憤怒。目前已經有很多針對倫理問題的文章和討論了，但是作為基因編輯領域的研究者，我們希望能夠從科學和技術的角度講清楚為什麼我們認為這個所謂的研究工作是非常錯誤的。正好也受到PLOS Biology邀請，所以我就和楊輝一起寫了這篇文章。」楊輝也認為，「從專業角度來說，我們更適合評價這一事件科學層面上的東西。」
據了解，這篇文章在提交後接受了由期刊編輯選定的外部專家的審稿，兩位作者也表示審稿意見非常中肯和有建設性。當「科研圈」提出，這篇文章能否代表國內基因編輯學者對賀建奎基因編輯嬰兒事件的看法時，兩位作者表示：因為沒有正式發表的論文，他們只能根據賀的報告內容進行評估；對於具體的科學和技術細節，可能還有有待其他同行可以補充的地方；但是對於此事的整體判斷，可以說是「國內外基因編輯領域學者共同的聲音」。
這篇文章也在某種意味上體現了科學共同體對賀建奎基因編輯嬰兒事件的態度和決心。「科研圈」對這篇文章進行了全文翻譯，希望能為所有關心這一事件的讀者提供更加準確的信息與參考。
基因編輯嬰兒：已經出現的問題以及可能存在的風險
王皓毅1，2，3楊輝4，5，6
1 中國科學院動物研究所幹細胞與生殖生物學國家重點實驗室，2 中國科學院幹細胞與再生醫學創新研究院，3中國科學院大學，4 中國科學院上海生命科學研究院神經科學研究所神經科學國家重點實驗室，5 中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心，6 上海腦科學與類腦研究中心
2018 年 11 月 25 日，時任南方科技大學副教授的賀建奎宣布，兩名攜帶經過編輯的CCR5基因的嬰兒已經在中國誕生（譯者註：南科大在 3 個月後宣布與賀建奎解除勞動關係）。他宣稱，這個基因修正將讓嬰兒對 HIV 病毒感染免疫。11 月 28 日，賀在第二屆國際人類基因組編輯峰會上展示了項目實驗數據。儘管目前實驗的基本證據仍未披露，相關聲明的真實性仍不明確，賀在峰會上展示的實驗設計和數據已經暴露出嚴重的科學問題和倫理問題。作為來自中國基因編輯領域的研究人員，我們對這一事件感到十分震驚。賀的工作看起來是秘密進行的。根據我們目前所了解的信息，賀從未在基因編輯領域發表過有影響力的科研論文，在中國的基因編輯學界也並不活躍。我們對這起極端不負責任的行為感到極其憤怒，這明顯違反了中國乃至全世界各個國家的法律法規和醫學倫理。在此，我們假設賀展示的數據是真實的，並從科學的角度對該實驗做出評價。因為我們相信，如果要對這次事件進行負責任的審查和討論，必須充分了解其中的科學事實。
2018 年 11 月 28 日，賀在第二屆國際人類基因組編輯峰會上展示項目實驗數據。圖片來源：bbc.com
實驗本身的合理性存疑
首先，我們要批評實驗的整體理念。賀宣稱，對CCR5基因進行編輯是為了避免嬰兒感染 HIV 病毒，因為孩子的父親是 HIV 攜帶者（母親不攜帶病毒）。但是，要想避免 HIV 傳染給胎兒，在胚胎中進行基因編輯是完全不必要的。HIV 陽性的父親可以通過完善的輔助生殖技術（Assisted Reproductive Technology，ART）孕育健康的後代，這一技術有極高的成功率 [1]。至於未來對 HIV 感染的防範，只要避免可能的 HIV 暴露風險，對大多數人來說就足夠了。因此，編輯早期胚胎不能給嬰兒帶來好處，卻在多方面帶來了潛在的嚴重風險，接下來我們將討論這部分內容。
CCR5基因編碼白細胞上的一個受體蛋白，HIV-1 利用它和另一種受體感染人體細胞。某些特定歐洲人群攜帶一個自然發生的等位基因CCR5Δ32，儘管攜帶該基因的雜合與純合個體的 HIV 感染都發展得更緩慢，或者對 HIV 感染免疫 [2,3]，但是就算是純合個體，也能被某些 HIV 毒株感染[4]。攜帶CCR5Δ32的個體總體上是健康的，但這個等位基因在非歐洲人群中出現的概率極低，並且中國人群中目前仍未發現純合個體 [5,6]。因此，很難預測將CCR5Δ32或其他CCR5等位基因突變引入中國遺傳背景的風險。儘管賀宣稱他準備了長期的健康追蹤計劃，沒有細節信息表明誰會對此提供資金支持，也不清楚當醫療事故發生時如何進行責任評估。
CCR5Δ32基因分布比例。
圖片來源：Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers
實驗整體科學水平堪憂
接下來，我們將討論賀的數據。賀一開始展示了CCR5基因敲除小鼠的數據，以評估「在胚胎期通過 CRISPR/Cas9 基因編輯技術敲除CCR5是否會造成預期外的遺傳學、生理學或行為學影響」（引號中內容直接引用自賀的展示幻燈片）。這太荒唐了。僅僅通過對比四個不同組織的組織學染色結果，而不進行量化評估，再加上兩個簡單的小鼠行為學實驗，不可能回答以上問題。
這項研究的科學水平很低，並且流於表面。例如，新奇物體探索行為測試（novel object investigation behavior test）的數據顯示，儘管 P 值大於 0.05（譯者註：這代表兩組數據在統計學上沒有顯著差異），但野生型小鼠和CCR5敲除小鼠的表現仍存在明顯差異。為了證明CCR5敲除不會產生任何行為表型，需要在更大的樣本中進行進一步評估。簡單進行文獻搜索就能發現，CCR5編碼的蛋白是一個趨化因子受體，具備正常的免疫功能，而CCR5敲除小鼠的自然殺傷細胞相關表型會導致多種病毒感染風險增加[7-9]。
混亂的編輯結果和被低估的風險
接下來，賀設計了多個單鏈嚮導 RNA（single-guide RNAs, sgRNAs），並在人類細胞系和猴子胚胎中測試了它們的有效性——這在基因編輯實驗中是很常見的操作。CRISPR-Cas9 編輯系統被送進細胞後，其基因組靶點上的 DNA 雙鏈繼而發生斷裂。隨後DNA修復系統開始工作，這時參與修復的可能是非同源末端連接（nonhomologous end joining, NHEJ）修復，或者同源介導/重組修復（homology-directed repair, HDR）。NHEJ 常會導致一小部分鹼基的插入或缺失（indel），但 HDR 能在編輯靶點完成對斷裂 DNA 的完美修復或精確修改。
DNA雙鍵斷裂後的兩種修復模式。圖片來源：emendobio.com
賀的展示中只對 NHEJ 修復導致的鹼基插入或缺失做了描述，但是我們沒有看到任何數據反映出能產生CCR5Δ32的 HDR 修復。這說明賀原本的實驗目的並不是創造CCR5Δ32。據我們所知，除了CCR5Δ32之外，人體中其他天然突變的CCR5indel 等位基因並不常見。以往的研究發現，兩個CCR5等位基因均突變的個體表達的、可穩定存在的截短型CCR5Δ32蛋白可能參與 HIV 感染免疫表型的出現[10]。因此在考慮基因編輯帶來的益處與風險時，我們不能把其他種類的CCR5突變和CCR5Δ32混為一談。此外，沒有改變三聯體密碼子讀碼框的基因編輯也很可能產生功能獲得性突變，其風險更加難以預測。
賀建奎還試圖利用猴子受精卵進行了顯微注射方法的優化，並且通過測序評估了基因編輯的效力和細胞嵌合水平（譯者註：基因編輯可能會導致一個胚胎中的不同細胞各自具有不同的基因型，這種現象被稱為嵌合體）。由於他的數據未被任何期刊或出版平台正式發表，PPT 展示出的內容不足以讓我們下定論。我們只能說，根據他在會議上的展示，猴子胚胎實驗中的嵌合體問題並沒有得到解決。
接下來，賀建奎開始給人類胚胎實施顯微注射。根據他的數據和之前的研究， 用 Cas9 蛋白代替 Cas9 mRNA，在減數第二次分裂中期（metaphase II, MII）注射進胚胎能夠減少嵌合體的比例，但並不能完全避免嵌合現象發生[11，12]。而且這種策略只在 NHEJ 介導的基因敲除中有用，對於 HDR 介導的精確基因修復則不然。雖然目前已經出現了很多在細胞水平增強 HDR 修復的方法[13]，但是這些方法能否用於人類胚胎還是個未知數。
Mitalipov 課題組的研究顯示母源等位基因是修復過程的模板，能夠修正病理性突變[12]。但其他課題組並不同意這一觀點：Cas9 可能會導致大範圍的鹼基刪除或重排，而且導致以 PCR 為基礎的基因分型檢測得到假陽性結果（譯者註：這裡的假陽性意味著實際上沒有被成功編輯的基因，但在檢測過程中被認為成功達到了編輯目的）[14]。上述爭論傳達了這樣的事實：目前學界對於 DNA 修復機制、人類早期胚胎基因編輯的後果的理解仍然不全面，也反映出賀很可能低估了嵌合體的發生率，也低估了基因改造帶來的風險。
未被解決的脫靶和中靶突變
為了評估編輯脫靶所造成的突變，賀建奎用經過編輯的人類胚胎建立了一個人類胚胎幹細胞（human embryonic stem cell, hESC）系。這項實驗的科學質量又一次沒有達標。他從一個經過編輯的胚胎中只得到了一個 hESC 系，隨後它被用來進行全基因組測序（whole-genome sequencing, WGS），以檢測潛在的脫靶突變。在 hESC 的分離和擴增過程中，可能會發生許多遺傳變異 [15]。因此，為了識別出真正由基因編輯脫靶導致的突變，需要從經過編輯和未經過編輯的胚胎中取出細胞建立多個 hESC 系，進行深度測序和大量的生物信息學分析。
賀進一步宣稱，他對 19 個經過編輯的人類囊胚的植入前遺傳診斷（preimplantation genetic diagnosis , PGD）樣本進行了單細胞全基因組測序，以評估基因編輯的中靶（on-target）和脫靶情況，然後才決定哪些胚胎可以植入母體。19 個胚胎中有 12 個含有CCR5野生型等位基因，表明CCR5在這些胚胎中未得到完全編輯。重要的是，目前還沒有成熟可靠的單細胞全基因組測序技術能夠評估脫靶突變[16]。這項技術需要藉助全基因組擴增，將基因組中的單個拷貝擴增到足夠的量，這一過程會引入許多人為突變 [16]。此外，嵌合體問題也是一個重要的顧慮，這無法通過 PGD 來評估，因為我們無法對一個胚胎中的所有細胞進行測序 [17]。這意味著即使被測序的細胞得到了正確的編輯，不可忽視的風險仍然存在——胚胎中的其他細胞可能沒有經過編輯，或攜帶預期外的突變，從而導致無法預測的後果。因此，賀的說法是不可靠的。
脫靶效應會產生有害後果。圖片來源：Gene Editing QC
除了脫靶效應之外，還有研究報告 CRISPR-Cas9 引發的雙鏈斷裂可能導致中靶誘變效應（on-target mutagenesis effects）[18,19]。除了不同類型的插入、刪除、轉位、重排之外，中靶誘變還包括大範圍染色體刪除、染色體截短、同源基因間修復導致的基因組純合。目前沒有一種單一手段能夠檢測所有類型的中靶突變，尤其是當它們的發生頻率很低的時候。
在兩名女嬰誕生後，賀的團隊從臍帶血、臍帶和胎盤中採集了 DNA，進行全基因組測序，並宣布CCR5編輯成功。全基因組測序結果顯示，這些樣本中各只存在兩種不同的CCR5等位基因。分別占測序結果的大約一半。對於露露，一個等位基因保留了野生型，而另一個等位基因出現了非移碼刪除（in-frame deletion，少了 15 個鹼基。譯者註：即剛好有 5 個三聯密碼子被刪除，因此其他未被刪除的基因所表達的蛋白不會發生改變）。對於娜娜，在全部測序結果中，CCR5的靶位區域都出現了兩個CCR5等位基因突變，這表明娜娜的所有樣本都沒有受到母親身體組織（其中含有 CCR5 野生型等位基因）的污染，這點實在令人驚異。但是，因為樣本採集和數據分析的細節缺失，我們無法得出明確的結論。我們強烈建議相關機構對所有的原始數據進行徹底檢查，並對學界和公眾披露事實。
總而言之，基於目前所了解的信息，我們確信在科學角度上，沒有可靠的理由來對人類生殖細胞進行這種類型的基因編輯，賀建奎及其團隊不僅嚴重違反了中國的法律法規，也違反了國際科研群體所達成的共識。我們在科學和倫理角度對他們極度不負責任的行為提出強烈譴責。我們強烈要求國際科研群體和監管機構儘快發起一場徹底的討論，為以生殖為目的的人類生殖細胞基因組編輯建立守則和標準。在達成明確共識後，需要在國際水平上通過、建立和執行明確而嚴格的規定。不過我們同時相信，進一步發展和改進相關技術，在體外實驗環境下對人類生殖細胞（包括早期胚胎、精子和卵母細胞）進行精確的基因修飾，是十分必要的。只有對特定疾病的治療達成共識，並針對性建立指導方針後，這項改進過的技術才有可能被用於應對遺傳疾病。
後記
巧合的是，中國科學院科研道德委員會在這篇文章正式發表的前一天下午，就生物醫學研究中有悖於倫理規範的常見問題發出「倫理提醒」，倡導在科研實踐中恪守各類倫理要求，努力營造風清氣正的科研生態（鏈接）。
正如王皓毅和楊輝在文中所說，只有充分了解其中的科學事實，我們才可能對這一事件進行負責任的審查和討論，進而建立明確而嚴格的守則和標準，避免再次出現科學和倫理上的「暴行」。
References
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