發現小分子抑製劑可以精確控制CRISPR-Cas9的基因編輯

研究人員5月2日在Cell雜誌上報道，首次發現化膿性鏈球菌Cas9（SpCas9）蛋白的小分子抑製劑可以更精確地控制基於CRISPR-Cas9的基因組編輯。

通過開發一系列高通量生物化學和基於細胞的分析，研究人員篩選了多種小分子，以鑒定破壞SpCas9與DNA結合從而干擾其切割DNA能力的化合物。這些第一種小分子CRISPR-Cas9抑製劑很容易進入細胞，並且比先前發現的抗CRISPR蛋白小得多。這些新化合物可以對基於SpCas9的技術進行可逆和劑量依賴性控制，包括其在哺乳動物細胞中進行基因編輯，鹼基編輯和表觀遺傳編輯的應用。

目前，SpCas9正在開發作為多種疾病的基因治療劑，包括HIV，視力障礙，肌肉萎縮症和其他遺傳性疾病。但是，這些治療應用將極大地受益於對SpCas9活性的劑量和時間的精確控制以減少脫靶效應。控制SpCas9活動的這些方面也可以使其他應用受益，例如有效編輯模型生物的DNA以模擬和研究疾病，以及基因驅動在基因工程蚊子工程蚊子中的使用，以遏制瘧疾和其他蚊子傳播疾病。

對SpCas9的劑量和時間控制的需求已經產生了對抗CRISPR分子的需求。儘管存在靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白，但它們很大並且對細胞不可滲透，在行動中不可逆轉，可被蛋白酶咀嚼，並且可能在體內造成不良免疫反應的風險。相反，小分子抑製劑是蛋白水解穩定的，可逆的，並且通常是非免疫原性的，並且可以通過被動擴散容易地遞送至細胞。此外，它們可以低成本大規模合成，且批次間變異性小。

在這項新研究中，Choudhary及其團隊推出了一個強大靈敏且可擴展的平台，用於快速經濟地鑒定和驗證SpCas9的小分子抑製劑。由於SpCas9酶的特性，以高通量方式測量CRISPR-Cas9活性以允許藥物篩選一直是具有挑戰性的。在新論文中，Choudhary及其同事分別開發了針對SpCas9-DNA結合和SpCas9 DNA切割活性的高通量初級和二級檢測。對於初步測定，他們使用稱為熒光偏振的生物化學技術來監測SpCas9與含有PAM序列的熒光團標記的DNA片段之間的相互作用。在二級測定中，他們使用自動顯微鏡來測量由SpCas9介導的細胞中報告基因的DNA切割誘導的熒光變化。

使用這些分析技術，研究人員首先篩選了多類小分子的代表成員，以確定其成員經常抑制SpCas9的類別。該團隊確定了兩種先導化合物，這些化合物破壞了SpCas9在人類細胞系中以劑量依賴性方式結合DNA和抑制SpCas9介導的DNA切割的能力。由於它們通過酶阻斷DNA結合，因此這些分子還抑制SpCas9的催化受損技術，包括用於轉錄激活的技術，並且在人血漿中是穩定的。

「這些結果為CRISPR-Cas9技術的精確化學控制奠定了基礎，使得能夠安全使用這些技術，」Choudhary說。 「然而，這些分子還沒有為人類應用做好準備，也沒有在生物體內進行功效測試。」

在未來的研究中，研究人員計劃在SpCas9：gRNA複合物上鑒定抑製劑的結合位點，檢查其作用機制，並優化其效力。他們還將確定分子是否與哺乳動物細胞中的其他靶標相互作用，並評估它們對其他CRISPR相關核酸酶的特異性。細胞論文中包含的早期結果表明，這些分子對其靶標非常特異，因為它們對遠緣相關的CRISPR酶Cas12a沒有影響。

來源

Discovery of small-molecule inhibitors could enable precise control over CRISPR-Cas9 genome editing

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