研究發現蓽茇醯胺可能是治療帕金森病的潛在藥物

蓽茇醯胺（Piperlongumine，PLG) 是傳統中草藥蓽茇的一種生物鹼單體成分，其具有較好的抗炎、抗氧化作用，且PLG已經證實可以在魚藤酮、6-OHDA、 MPTP等多種 PD 模型中起到神經保護作用。

首都醫科大學基礎醫學院楊慧教授課題組發現魚藤酮處理造成線粒體損傷及細胞凋亡，而 PLG 治療後可以通過激活MAPK8信號通路，從而促進抗凋亡蛋白Bcl-2 磷酸化，後者一方面通過促進其與促凋亡蛋白Bax發生相互作用抑制細胞凋亡，另一方面通過與 Beclin1 發生解離而激活自噬，進而清除受損線粒體，間接抑制細胞凋亡，最終通過調節自噬、凋亡再平衡而發揮神經保護作用（圖1）。

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圖1. PLG通過促進BCL2磷酸化恢復細胞凋亡和自噬之間的平衡。

這一重要成果以「Piperlongumine restores the balance of autophagy and apoptosis by increasing BCL2 phosphorylation in rotenone-induced Parkinson disease models」為題發表於Autophagy（21 Feb 2018；自噬領域TOP期刊，2018年IF = 11.100）。

研究思路與方法

課題組首先發現，PLG可以緩解魚藤酮誘導的PD動物模型中腦黑質多巴胺能神經元缺失以及運動行為學障礙，且線粒體可能為 PLG 的干預靶點（圖2）。

圖2.PLG對魚藤酮動物模型的神經保護作用。

隨後，發現PLG可以緩解魚藤酮誘導的 Complex I 活力下降， mPTP 的開放，進而穩定線粒體膜電勢而發揮細胞保護作用（圖3）。

圖3. PLG緩解魚藤酮誘導的線粒體損傷。

上述結果初步表明PLG通過保護線粒體功能而緩解魚藤酮誘導的細胞損傷。

第二步，課題組使用魚藤酮和 PLG 處理各組細胞後，通過 western blots 的方法對各組細胞裂解液中自噬標誌物 LC3-I 向 LC3-II 的轉化情況和自噬底物 p62（SQSTM1） 的蛋白水平進行了檢測，結果發現PLG 治療組中自噬標誌物 LC3-II 水平顯著增加， 而自噬底物 p62 水平有所降低，提示 PLG 與魚藤酮共處理的情況下可以激活細胞內自噬水平（圖4）。

圖4.PLG誘導魚藤酮細胞模型內自噬的發生。

此外，課題組通過mRFP-GFP-tagged LC3-expressing virus（吉凱基因構建）感染SK-N-SH細胞和原代神經元細胞以觀察自噬小體生成狀況，並通過 Mito Tracker red 標記線粒體， 以觀察了二者的共定位情況。結果顯示，在魚藤酮與 PLG 共處理組中，出現了明顯的 LC3的綠色熒光點狀聚集體，並且這些綠色熒光聚集體可以與 Mito Tracker 標記的紅色線粒體發生共定位，提示在該處理組中存在線粒體和自噬小體的共定位，即自噬可能參與了線粒體的降解（圖5）。

圖5. PLG激活自噬有助於受損線粒體的清除。

第三步，課題組接下來使用免疫共沉澱的方法探究 PLG 對自噬的誘導作用是否是通過影響了Bcl-2-Beclin1 的相互作用情況。結果顯示，與魚藤酮組細胞相比， PLG 治療組 Bcl-2-Beclin1 的相互作用水平明顯降低，提示 PLG 處理可能通過促進了二者的解離而發揮了自噬激活作用。而抑制 Bcl-2 可以使 PLG 失去了對 Bcl-2-Beclin1 的解離作用，進一步提示了 Bcl-2 可能是 PLG 的作用靶點。此外，在 PLG 與魚藤酮共處理組中， Bcl-2 ser70 位點的磷酸化水平較魚藤酮模型組顯著增加，提示 PLG 處理促進了 Bcl-2 ser70 位點發生磷酸化。以上結果提示，PLG 可能通過作用於Bcl-2 ser70 位點，促進Bcl-2-Beclin1 發生解離，從而誘導自噬的發生。

第四步，課題組進一步檢測了Bcl-2-Bax 的相互作用情況，以評估 PLG 是否可以通過影響 Bcl-2-Bax 異源二聚體的形成而調節細胞凋亡。結果顯示，與魚藤酮組細胞相比， PLG 治療組中 Bcl-2-Bax 的相互作用水平增加，後者可以直接抑制細胞凋亡。綜上提示， PLG 處理可以通過增加 Bcl-2 ser70 位點的磷酸化水平，穩定 Bcl-2-Bax 異源二聚體，從而抵抗細胞凋亡。

第五步，最後，課題組檢測了 Bcl-2 上游蛋白 MAPK8的激活情況，其激活可以通過磷酸化水平表徵。結果顯示，與魚藤酮組細胞相比， PLG 治療組 p- MAPK8 水平顯著增加， 且這與 Bcl-2 磷酸化水平增加的結果相一致，提示 PLG 是通過激活了 MAPK8信號通路，從而促進了 Bcl-2 ser70 位點的磷酸化。此外，以上結果均在動物實驗上也得到了驗證，即 PLG 治療後，可以通過激活 MAPK8信號通路而增加 Bcl-2 ser70 位點的磷酸化水平，後者一方面促進 Bcl-2-beclin1 發生解離從而激活自噬，另一方面穩定 Bcl-2-Bax 異源二聚體，從而抵抗細胞凋亡。

研究結論

PLG可以減輕魚藤酮誘導的PD動物模型中的運動損傷和中腦多巴胺能神經元的損失，還改善了由魚藤酮引起的細胞活力下降，抑制細胞毒性。這些保護作用通過激活MAPK8通路增加Bcl2 Ser70位點的磷酸化來抑制細胞凋亡和誘導自噬。這一發現表明靶向Bcl2恢復細胞凋亡和自噬之間的平衡可能是PD的有效治療方法。

作者簡介

首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系楊慧教授為本文通訊作者，劉佳為本文第一作者。

楊慧教授，女，首都醫科大學二級教授，博士生導師，北京神經科學學會理事，國務院政府特殊津貼專家。主要學術成就：近年來的研究表明帕金森病主要病因與基因、環境和老化相關，三者相互作用產生惡性循環最終導致神經元死亡，但具體相互作用的機制不清。楊慧教授主要在基因和環境相互作用方面進行研究，獲得了一定的突破性進展，為帕金森病相關基因α–Syn，GBA，DJ和PINK1的制病分子機制及相互作用關係提出了新的觀點。並以此為干預靶點發現了新的可能的化合物，為探索帕金森病治療提供了有意義的成果。並在探索神經退行性疾病生物標誌物上取得了一定的研究成果，並有望轉化到臨床應用研究中。具有國家級各類課題，包括國家重點項目的973、863和國家自然科學基金課題，具有北京市級多種課題。發表的學術論文210篇其中SCI收錄論文80篇；授權的國家發明專利8項；獲得北京市科技進步一等獎一項。

劉佳，女，28歲，首都醫科大學基礎醫學院2016級在讀博士研究生，研究方向為自噬-凋亡平衡紊亂參與帕金森病的發病機制及其干預研究，並以第一或共同第一作者發表SCI文章5篇。

（來源：brainnews）

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