環吡咯通過阻斷衣殼裝配抑制乙型肝炎病毒分泌

| 編譯：周彩欣，魏韜，鄭倩望（華南農業大學食品學院）

慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，以下簡稱HBV）感染可導致肝硬化和肝細胞癌。2017年10月27日，世界衛生組織國際癌症研究機構公布的致癌物清單初步整理參考，HBV感染在一類致癌物清單中。感染患者目前接受核苷/核苷酸類似物和干擾素α治療，這種方法雖有療效，但是效率低，因此是一個嚴重的公共衛生問題。

在2019年5月16日《Nature Communications》上發表了一篇名為Ciclopirox inhibits Hepatitis B Virus secretion by blocking capsid assembly的文章。通過篩選了978種FDA批准的化合物，它們能夠抑制HBV表達的Hepg2.2.15細胞中的HBV複製，他們發現，環吡咯是一種合成的抗真菌劑，通過阻斷乙肝病毒衣殼的裝配，可以強烈抑制乙肝病毒在細胞和小鼠中的複製。環吡咯與核苷/核苷酸類似物協同作用，以防止細胞和人源化肝小鼠模型中的HBV複製。

Hepg2.2.15細胞是AYW亞型（D型）HBV複製子穩定整合的細胞。在研究過程中，Junk-Ah Kang等人通過在高通量篩選，將這些細胞暴露於每種化合物的1μm中3天，觀察它們對HBV DNA分泌的影響。以1μm恩替卡韋（ETV）處理為對照。用HBV DNA引物和探針裝置定量PCR檢測HBV DNA分泌，經ETV孵育3天後，HBV DNA顆粒分泌減少42.1±14.1%。在測試化合物中，至少19種與ETV一樣有效。然而，由於19種化合物中的一些的抑制效果差異很大（圖1a），他們以更長的治療周期（6天）重複試驗。13種化合物穩定地抑制了HBV DNA的分泌（圖1b）。然後他們通過定量PCR評估這19種化合物對細胞內HBV轉錄的抑製程度。四種化合物顯著降低了細胞內HBV轉錄水平（圖1c）。最後，分析了這19種化合物對HBV胞內衣殼形成的影響。只有環吡咯抑制乙肝病毒衣殼裝配（圖1d）。

總的來說，結果顯示環吡咯最有效地抑制了HBV DNA的分泌（圖1b），可能是通過抑制HBV衣殼的組裝。因此，他們將環吡羅作為一種抗HBV化合物進行了評價。

他們還從環吡咯抑制體外和細胞內乙肝病毒衣殼裝配、複合HBV核心蛋白的總體結構、對HBV核心蛋白結合位點的表徵、在體外感染模型中抑制HBV複製以及與TDF或ETV聯合治療的效果等方面進行了深入的實驗研究。

具體結果如下：

1. 環吡咯體外HBV衣殼組裝的半最大抑制濃度（IC50）為445±17 nm，另外，測試驗證了環吡咯與抑制HBV衣殼組裝相比，破壞組裝的HBV衣殼的能力效率較低（27μM）。在細胞內，環吡咯也抑制HBV衣殼裝配，IC50為2.9±0.3μm，總變性HBV核心蛋白不受影響，但如果處理時間延長，其總核心蛋白也會減少。因此，環吡咯在體外抑制HBV外殼的正常組裝。

2. 環吡咯僅與其他組裝調節劑結合的六個位點中的三個結合。其次，除了廣泛的疏水相互作用外，Y118還與環吡咯形成必需的氫鍵和鹽橋，將其錨定在結合口袋中。HBV核心蛋白和環吡咯複合體的晶體結構揭示了二聚體-二聚體界面的獨特結合模式。

3. 118（Y118F）通過酪氨酸突變為苯丙氨酸來破壞氫鍵，顯著降低了環吡咯介導的對正常HBV衣殼組裝的抑制作用。

4. 環吡咯以劑量依賴性方式降低細胞內HBV DNA水平。定量PCR分析顯示，環磷醯胺對HepG2.2.15和轉染細胞分泌HBV DNA 的IC50值為880±70 nM和750±150 nM。定量PCR分析還顯示細胞內HBV DNA 的IC50值分別為800±100 nM和800±180 nM。因此，環吡酮抑制兩種細胞系中的HBV DNA產生。同時，環吡酮對HBsAg產生或HBV轉錄物水平沒有影響。簡單來說，環吡酮通過抑制HBV衣殼組裝來抑制含有病毒DNA的顆粒的分泌，而不是由於細胞毒性或限制HBV轉錄或HBV蛋白的產生。

5.用環吡酮處理NTCP表達的HepG2和Huh-7細胞後，HBV DNA的分泌，cccDNA水平和細胞內鬆弛的環狀DNA水平顯著下降。可知，環吡咯阻斷了這些細胞系中的HBV複製，表明它可能對開發新的抗HBV藥物有用。

6. 環吡咯可以與已建立的藥物如TDF和ETV協同抑制HBV複製。

觀察結果表明，環吡咯可與HBV核心蛋白結合如下。首先，在HBV衣殼形成之前或之後，它優先與一半可能的結合囊結合；這導致必要的二次相互作用，並引起亞單位的結構變化。因此，可能形成高度不對稱的二聚體，從而導致形成不規則或畸形的HBV衣殼，產生較少的HBV病毒。不幸的是，目前的數據不允許他們確定為什麼環吡咯有一個獨特的結合位點偏好，或者環吡咯和TDF和ETV如何協同抑制HBV複製。

綜上所述，口服環吡咯可通過阻斷乙肝病毒衣殼的裝配，為治療慢性乙肝病毒感染提供新的機會。

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