微生物所在流感病毒聚合酶調控RNA合成機制研究領域取得進展

流感病毒是危害全球公共衛生健康的重要病原之一，能在人群中引起大規模流行和季節性流感，每次暴發都會引起人類死亡並造成巨大的經濟損失。流感病毒（Influenza virus）是分節段的負鏈RNA病毒（Segmented Negative-Sense RNA virus, sNSV），屬於正粘病毒科（Orthomyxoviridae），目前包括A，B，C和D四種類型。由於流感病毒易發生基因重配和抗原突變，現有疫苗無法提供持久性保護，再加上流感病毒的耐藥性問題出現得越來越頻繁，開發新型的抗病毒藥物已然迫在眉睫。流感病毒聚合酶對於病毒複製增殖和宿主適應都具有重要作用，並且在不同類型流感病毒中較為保守，是抗病毒藥物研發的重要靶點。因此對於流感病毒聚合酶工作機制的探索一直是研究熱點。

流感病毒聚合酶（Influenza virus polymerase，FluPol）由PA（在C型和D型流感病毒中為P3）、PB1和PB2三個亞基組成，並以核糖核酸蛋白（ribonucleoprotein，RNP）複合物形式來行使病毒基因組複製和轉錄雙功能。病毒基因組複製過程可以分為兩步：第一步通過結合保守的病毒RNA（viral RNA，vRNA）啟動子（promoter）從末端起始從頭合成互補RNA（complementary RNA，cRNA）；第二步通過結合保守的cRNA啟動子，從內部起始從頭合成病毒基因組RNA產物。病毒基因組轉錄過程則依賴宿主細胞的RNA PolII複合物，通過掠奪並利用宿主來源的加帽RNA（capped RNA）作為引物合成轉錄產物（messenger RNA，mRNA），從而啟動後續病毒蛋白的表達。病毒聚合酶合成RNA過程又可以進一步分為起始、延伸和終止三個階段。

過去五年里，前人通過晶體學技術成功解析了A，B和C型流感病毒聚合酶的結構，並對它們的複製和轉錄功能機制有了初步認識，但是關於D型流感病毒聚合酶的研究鮮有報道。同時流感病毒基因組的複製和轉錄過程是一個極為複雜的過程，除了聚合酶本身，還需要病毒RNA、其他病毒蛋白以及宿主因子的共同參與，才能高效準確地完成這個過程。目前對於這個複雜過程的認知尚有許多空白，亟需研究人員去填補。

為了系統比較不同類型流感病毒聚合酶結構和功能特徵以及分析聚合酶在與不同RNA啟動子結合時的構象和工作機制，中國科學院微生物研究所研究人員以D型流感病毒聚合酶為對象來展開研究。首先利用昆蟲細胞表達系統，成功純化得到高純度聚合酶蛋白並在體外證明其具有生理活性；然後利用冷凍電鏡三維重構技術解析了D型流感病毒聚合酶複合體的近原子解析度三維結構。通過與A，B和C型流感病毒聚合酶的結構比較發現，它們都具有一個保守且構象穩定的核心區域，包括PA/P3亞基的C末端，PB1亞基和PB2亞基的N末端，以及柔性較大的外圍結構域，包括PA/P3亞基的內切酶結構域，PB2亞基的帽子結合域和核定位結構域等，提示不同類型的流感病毒聚合酶利用相似的機制合成RNA產物。

為了深入研究流感病毒聚合酶合成RNA的分子機制，研究人員利用冷凍電鏡三維重構技術，解析了D型流感病毒聚合酶與不同RNA啟動子結合的近原子解析度三維結構。研究人員首次發現vRNA啟動子存在兩種不同的結合構象（3』-vRNA能夠結合在兩個不同的位置），分別定義為mode A和mode B，但是cRNA啟動子只採取mode B方式與聚合酶結合（圖1）。通過大量的細胞複製子和體外酶活功能實驗表明，病毒基因組複製第一步cRNA的合成主要通過mode A構象進行調控，而mode B構象主要在複製第二步聚合酶合成vRNA時發揮作用，並且這一過程需要其他病毒或宿主因子的參與。而病毒基因組轉錄過程同時受到兩種構象的調控。此外，mode A和mode B構象在轉運至酶活中心後會共用同一個催化前構象，並且這一構象與mode A的結合位點部分重合（圖2）。

值得思考的是，處於mode B構象的3』-RNA位於聚合酶的表面而未進入酶活中心，通過生物膜干涉實驗發現3』-RNA與聚合酶親和能力非常強，那麼如何將處於mode B構象的3』-RNA轉運至酶活中心？研究人員通過動態光散射實驗分析不同狀態下D型聚合酶的聚體形式，結果顯示在加入啟動子後，聚合酶易於形成二聚體甚至寡聚體，並且cRNA啟動子更容易誘導這一過程。此前研究也曾報道過A型流感聚合酶能夠形成二聚體和四聚體。這些證據提示，不同聚合酶間的相互作用可能誘導其構象變化，從而促進處於mode B構象的3』-RNA轉運至酶活中心，但其分子機制還需進一步驗證和探索。

此項工作首次系統性地研究了流感病毒聚合酶與不同RNA啟動子的相互作用機制，闡明了RNA啟動子結合構象在合成不同RNA時所發揮的作用，並提出了聚合酶合成RNA起始階段的工作模型，推動了人們對流感病毒聚合酶調控不同RNA合成機制的理解，為抗病毒藥物開發提供了新靶點。

該研究成果已在線發表在《自然-微生物學》（Nature Microbiology）雜誌上，題為Structural insight into RNA synthesis by influenza D polymerase。微生物所施一研究組博士生彭齊、聯合培養碩士生劉雨騫和助理研究員彭如超為論文並列第一作者；研究員施一和中科院院士高福為論文共同通訊作者。該研究得到中國醫學科學院病原生物所研究員鄧濤、中科院生物物理研究所研究員章新政、南方科技大學冷凍電鏡中心教授王培毅、微生物所研究員齊建勛和嚴景華等的大力支持，並得到中科院戰略先導B專項、國家科技重大專項、中科院國際合作重大項目、國家自然科學基金委優秀青年科學基金和中科院青年創新促進會等的支持。

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